胰島內胰腺星狀細胞的分離鑒定及其對胰島β細胞的影響.pdf

1、目的：既往研究證實，胰腺星狀細胞（pancreatic stellate cell，PSC）可分泌多種細胞因子參與胰腺纖維化及細胞凋亡過程。本實驗旨在研究PSC是否存在于胰島中及其對胰島β細胞的影響。
　　 方法：1.以密度梯度離心法分離培養(yǎng)大鼠胰島，并運用外向生長技術及胰酶消化法從胰島中分離PSCs，分別以相差及熒光顯微鏡觀察其形態(tài)及自發(fā)熒光水平，并以免疫組化法檢測細胞中α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle ac

2、tin，α-SMA）的表達。2.運用密度梯度離心法分離大鼠原代PSCs。構建胰島β細胞株Ins-1/胰島與PSCs共培養(yǎng)系統(tǒng)，并分別以28mmol/L葡萄糖和（或）10IU/ml胰島素干預不同組別，以Annexin V-PI標記后行流式細胞術分析，檢測Ins-1凋亡水平；以MTT法（3-（4，5-methylthiazol-2-y1）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）檢測Ins-1增殖水平（以吸光

3、度值（Optical Densities，ODs）評估）；DAPI（4，6-diamidino-2-phenylindole，dihydrochloride，DAPI）核染法觀察Ins-1細胞凋亡形態(tài)；并以電化學發(fā)光免疫分析法（electrochemiluminescent immunoassay，ECUA）檢測胰島培養(yǎng)上清中C肽含量。
　　 結果：1.在熒光顯微鏡下觀察，可見胰島中存在自發(fā)熒光陽性細胞；培養(yǎng)14天后胰島周邊出現(xiàn)

4、星形細胞，α-SMA特異性染色呈陽性。2.Ins-1與PSCs共培養(yǎng)后，其凋亡率較單獨培養(yǎng)的Ins-1組明顯增加（5.03±0.40％vs3.73±0.35％，P<0.05），OD明顯下降（1.29±0.17vs2.85±0.31，P<0.05），胰島與PSCs共培養(yǎng)后上清中C肽分泌量較單獨培養(yǎng)的胰島組明顯減少（0.187±0.017 vs0.228±0.026 ng/ml，P<0.05）。3.單獨培養(yǎng)的Ins-1/胰島中，高糖組與空白

5、組相比，Ins-1凋亡率明顯增加（7.93±0.40％vs3.73±0.35％，P<0.05），OD明顯下降（2.29±0.13 vs2.85±0.31.P<0.05），胰島C肽分泌量明顯減少（0.182±0.009 vs0.228±0.026 ng/ml，P<0.05）；高胰島素組與空白組相比，Ins-1 OD明顯下降（1.68±0.21 vs2.85±0.31，P<0.05），胰島C肽分泌量明顯增加（0.334±0.026 vs0.

6、228±0.026 ng/ml，P<0.05）。4.Ins-1/胰島和PSCs共培養(yǎng)組與單獨培養(yǎng)的Ins-l/胰島組相比，高糖、高胰島素、高糖+高胰島素干預后，Ins-1凋亡率均明顯增加（11.73±1.21％vs7.93±0.40％，4.90±0.60％vs3.07±0.31％，10.30±1.00％vs6.53±0.50％，P<0.05），ODs均明顯下降（0.62±0.07 vs2.29±0.13，0.29±0.04 vs1.68

7、±0.21，0.14±0.04 vs0.59±0.08，P<0.05），胰島C肽分泌量均明顯減少（0.145±0，008 vs0.182±0.009 ng/ml，0.284±0.024 vs0.334±0.026 ng/ml，0.234±0.017vs0.287±0.009 ng/ml，P<0.05），并可在共培養(yǎng)組中觀察到更為典型的Ins-1細胞凋亡形態(tài)學變化。
　　 結論：1.PSC存在于胰島中，分離培養(yǎng)過程中可由靜止狀態(tài)轉