人工合成甘藍型油菜的遺傳和表觀遺傳變異分析.pdf

1、異源多倍體在進化過程中經歷了雜交與加倍，新基因組形成后會出現遺傳和表觀遺傳的變異現象，例如基因重排、基因組結構變異、轉座子激活、基因表達水平和表達模式的變化及DNA甲基化變異等。因此，探究異源多倍體在形成早期發(fā)生變異的可能機制，對豐富多倍體進化理論有重要的意義。異源四倍體甘藍型油菜（Brassica napusL.）由二倍體祖先種白菜（Brassica rapa L.）和甘藍（B.oleraceaL.）通過種間雜交后染色體加倍得到，因其

2、具有清晰系譜信息而成為研究植物異源多倍體化的重要對象之一。本實驗以課題組前期人工合成的甘藍型油菜及其二倍體親本（白菜與甘藍）為材料，分析了人工合成甘藍型油菜形成早期在形態(tài)學和細胞學等方面與親本之間的差異;同時，利用RNA-seq數據對異源多倍化的甘藍型油菜基因組中基因與轉座子的表達變異特征進行分析，從分子水平上探究甘藍型油菜基因組形成早期的基因組變異;另外，還利用分子標記技術探究了人工合成甘藍型油菜多倍化過程中DNA甲基化與轉座子的多態(tài)

3、性變異情況及可能的形成機制。主要結果如下:
　　1、人工合成甘藍型油菜與二倍體親本表型比較分析
　　比較人工合成甘藍型油菜及其二倍體親本白菜和甘藍的形態(tài)學（如株型、葉片和花器官）和種子細胞學，發(fā)現人工合成甘藍型油菜在表型上發(fā)生一系列變化，主要包括:
　?、僦仓曛晷洼^大且為松散型，有效分枝數較多，分枝部位較低，一次有效分枝的結角數較多，每角粒數變多等。
　?、谌~表皮不光滑、葉脈有少量表皮毛，葉緣呈鋸齒狀且有表皮毛，

4、有葉耳。
　?、刍ò晷螒B(tài)與甘藍相似，花瓣顏色接近白菜，但花粉活力明顯比親本的強(分別為97.1％、92.1％和75.09％)。
　　④在單位面積內葉表面氣孔數目增多、密度較大，但氣孔的長度和寬度比白菜小。
　　⑤利用光學顯微鏡與電子顯微鏡觀察和比較成熟種子內部顯微結構差異。結果顯示:白菜、甘藍的種皮紋飾和網脊形態(tài)差異明顯，雜種后代種皮紋飾接近白菜、呈網紋狀，脊條粗短有微穴并與甘藍相似。白菜的柵欄層細胞呈深褐色，甘藍的柵

5、欄層細胞呈淡黃色，而雜種后代的柵欄層顏色介于兩個親本之間。雜種后代的糊粉層細胞最厚，甘藍的最薄。三者胚根中央分生細胞的蛋白體面積顯著低于胚根周圍薄壁細胞，而油體相對面積則相反;其中雜種后代中央分生細胞中的蛋白體面積最高，周圍薄壁細胞中蛋白體面積居于二者之間。雜種后代子葉中蛋白體積累最少，油體的體積最大且以長形為主，而兩親本子葉中蛋白體積累相對較多，油體較小呈圓形或橢圓形。
　　2、人工合成甘藍型油菜和二倍體親本的轉錄組比較研究

6、r>　　利用RNA-seq技術對人工合成的甘藍型油菜及其親本的葉片轉錄組進行比較分析，結果包括:
　　①在白菜型油菜、甘藍及人工合成甘藍型油菜中檢測到表達的基因分別為21，491、21，947和40，544。甘藍型油菜與白菜相比有183個基因上調、2，192個基因下調;與甘藍比較有548個基因上調、1，894個基因下調。這些后代與親本之間的差異表達基因主要與物質合成、信號轉導、響應脅迫等生物學過程有關。
　　②對雜種后代中1

7、7，823對部分同源基因的表達特征進行分析，發(fā)現多數部分同源基因(占63.77％)的表達模式與兩個親本的表達模式一致，可認為多倍化過程中部分同源基因對的表達模式比較保守;通過部分同源基因對的表達偏好性分析發(fā)現12，221個基因的表達水平沒有差異，即它們不存在表達偏好性，另有2，322個部分同源基因對偏向A基因組表達，3，280個部分同源基因對偏向C基因組表達。
　?、蹖Σ町惐磉_的部分同源基因對進行分析發(fā)現，713個基因以加性表達形

8、式出現;分別有2，628個和3，162個基因以C-ELD(C-Expression Level dominance)和A-ELD(A-Expression Leveldominance)形式出現;而超親下調或上調表達的基因有54個和1，056個?；蚬δ茏⑨尫治鲲@示C-ELD和A-ELD類型的基因與水楊酸合成、防御生物脅迫、MAPK途徑、RNA甲基化、核苷酸生物合成、rRNA加工及蛋白質運輸等相關;超親上調表達的基因涉及色素、類黃酮及有

9、機物等物質的生物合成過程。
　　3、人工合成甘藍型油菜和二倍體親本轉錄組中轉座子的分析
　　深入挖掘RNA-Seq數據，利用比較基因組學的手段從全基因組層面分析了人工合成甘藍型油菜與二倍體親本（甘藍和白菜）之間轉座子含量、種類和數量分布、表達模式及表達水平等方面的差異，結果表明:
　　①兩個親本轉錄組中轉座子所占比例分別為32.56％和14.76％，人工合成甘藍型油菜轉錄組中轉座子占的比例為18.09％。在三個物種轉錄

10、組中鑒定到了12種類型的轉座子(hAT、 CACTA、PIF-Harbinger、Mutator、Pong、Tc1/Mariner、Helitron、LTR/Copia、LTR/Gypsy、LTR/Unclassified、SINE和LINE)，其中占比例最多的是CACTA(2.02％～5.44％)、Pong(2.66～6.71％)、LTR/Copia(4.32％～10.90％)和LTR/Gypsy(2.20％～4.75％)，其他類型轉

11、座子在轉錄組中所占比例較小（約為0.09％～0.94％）。
　?、诟鶕PKM值判斷轉座子表達水平的差異，分析發(fā)現人工合成甘藍型油菜與白菜相比有154個表達上調和162個表達下調的轉座子;與甘藍相比有147個表達上調和190個表達下調的轉座子;數目最多的差異表達轉座子是CAC TA、Pong、LTR/Copia、LTR/Gypsy和三TR/Unclassified。
　?、廴斯ず铣筛仕{型油菜中轉座子的表達模式主要以新出現、沉

12、默及只在一個親本和雜種后代中表達的模式出現。
　?、軐D座子插入基因內部的偏好性分析發(fā)現，基因內含子區(qū)域比外顯子區(qū)更容易插入轉座子;對有轉座子插入的基因注釋分析，顯示這部分基因涉及細胞組分、生物進程和分子功能三個方面。細胞組分方面主要與細胞質、細胞核、葉綠體、質膜及色素等有關;生物進程方面主要與蛋白質代謝、抵抗脅迫、信號轉導、細胞組成和生物轉化、其他代謝途徑和細胞化進程等有關;分子功能方面與核苷酸結合、DNA(或RNA)結合、蛋白

13、結合、轉移酶活性、水解酶和其他酶活性有關。這些結果暗示著轉座子對基因組結構的形成和基因功能的發(fā)揮有重要作用。
　　4、人工合成甘藍型油菜基因組中的反轉座子及反轉錄酶序列分析
　　采用反轉座子插入位點間擴增多態(tài)性分子標記方法（Inter-Retrotransposon AmplifiedPolymorphism，IRAP）對人工合成甘藍型油菜全基因組中的反轉座子的變化規(guī)律和可能作用機制進行分析;同時也對反轉座子的反轉錄酶序列構

14、成和進化關系進行分析。
　　結果表明:
　?、?77對反轉座子引物進行隨機組合，共擴增出1，729個條帶，親本條帶占71.13％，雜種中消失與新增的條帶分別占5.73％和7.63％，未知條帶占15.50％，多倍化過程中反轉座子的激活頻率為0.134。
　?、诔晒寺×?0條包含有反轉座子的序列，并進行功能預測分析，結果顯示有反轉座子插入的基因主要與分子功能、生物進程及細胞組分三方面，其中比例最多的是催化或結合、特殊大分

15、子復合物、內膜系統(tǒng)、其他代謝過程等。這說明基因和反轉座子之間有緊密關系，可能對多倍體適應新環(huán)境有重要意義。
　?、劾眉娌⒁飳Ψ崔D座子的反轉錄酶進行擴增，成功分離和克隆了32條反轉錄酶序列，核苷酸序列長度變化范圍為275～284 bp，氨基酸序列中包含三個保守區(qū):TAFLHG、LYGLKQ和YVDDM，這說明反轉座子反轉錄酶序列具有同源性和高度異質性的特點。將克隆的序列與其他物種反轉錄酶的氨基酸序列進行聚類分析，發(fā)現它們具有同源

16、性，這意味著不同物種中的反轉座子在物種形成前可能擁有共同的祖先。
　　5、人工合成甘藍型油菜早期世代DNA甲基化的變化分析
　　DNA甲基化作為常見的表觀遺傳修飾，在多倍化過程中起著重要的作用。本研究以人工合成甘藍型油菜早期世代(F1，S1-S3)及其親本白菜型油菜和甘藍為實驗材料，通過DNA甲基化敏感擴增多態(tài)性（Methylation Sensitive Amplification Polymorphism，MSAP）技術

17、和高效液相色譜(High Performance LiquidChromatography,HPLC)技術對甘藍型油菜多倍化過程中DNA甲基化水平的動態(tài)變化進行分析。
　　結果表明:
　　①在F1中有53.4％的片段是來源于A和C基因組。除此之外，在雜種后代中分別有5.04％和8.87％的片段是屬于新增帶和消失帶。
　?、谂c二倍體親本相比，人工合成甘藍型油菜F1代中有13.1％的基因位點發(fā)生了甲基化的改變，其中有7.8

18、6％的位點屬于高甲基化，5.24％的位點屬于DNA甲基化。利用MSAP技術比較人工合成甘藍型油菜F1及S1-S3代中的DNA甲基化水平差異，發(fā)現F1的甲基化水平最低(38.7％)，S3世代中的甲基化水平最高(41.32％)。對DNA甲基化變異片段進行序列分析，發(fā)現其廣泛參與了多種生物學途徑，包括一些轉錄調控因子、蛋白修飾及轉運蛋白等。對DNA甲基轉移酶基因的表達進行分析發(fā)現，在不同的材料之中甲基化酶基因的表達水平與DNA甲基化狀態(tài)是一致