大豆GmFAD3C基因在花生中的表達及分析.pdf

1、必需脂肪酸(essential fatty acids)在人和高等動物體內不能合成,必須從食物中攝取.其中α-亞麻酸(α-linolenic acid,ALA,C18:3<'△9,12,15>)和亞油酸(linoleic acid,LA,C18:2<'△9,12>)是研究比較多的必需脂肪酸,α-亞麻酸屬于n-3多不飽和脂肪酸(PUFAs),它在體內經過一系列的脫氫和加長反應可以生成EPA、DHA等其它n-3 PUFAs.亞油酸屬于n-6

2、多不飽和脂肪酸(PUFAs),經過一系列反應可以生成γ-亞麻酸(γ-linolenic acid,GLA)、花生四烯酸(arachidonic acid,AA)等其他n-6PUFAs.n-6和n-3 PUFAs的功能在很多方面是相反的,它們相互協(xié)調制約,共同調節(jié)生物體的生命活動.所以n-6/n-3 PUFAs的膳食平衡非常重要,但是人的膳食中該比值一般嚴重偏高,n-6 PUFAs相對過量,n-3 PUFAs嚴重缺乏.這導致高血栓,動脈粥

3、樣化,癌癥的發(fā)病率增加,炎癥增強等癥狀.所以對油脂的研究方向應該是降低n-6/n-3PUFAs的比值,使其更加有利于人們的健康.對PUFAs的研究在分子生物學上體現在對PUFAs合成酶的研究.本試驗所應用的酶即是催化由LA向ALA轉化的酶. 花生是世界第四大油料作物,作為我國的主要油料作物,其總產居各油料作物之首.我國花生50﹪以上用于榨油,花生油中LA的比例為15﹪-43﹪,卻不含任何n-3PUFAs.因此通過轉基因方法使得花

4、生表達相關基因,促使部分LA轉變成ALA,是改變花生種質的一種有效方法.大豆(Glycine max)種子油中ALA含量較高.Bilyeu KD等2003年克隆了大豆GmFAD3基因.在未成熟種子中,GmFAD3A和GmFAD3C的表達量分別是持家基因的60﹪和0.2﹪,GmFAD3B未檢測到表達.并且他們發(fā)現GmFAD3A是大豆種子油中ALA水平主要貢獻者,其貢獻量是GmFAD3C的三倍.后來他們又發(fā)現GmFAD3A完全突變后,花生油

5、中α-亞麻酸減少量大約為46g Kg<'-1>油<'[-]>;而GmFAD3C完全突變后,花生油中α-亞麻酸減少量大約為15g Kg<'-1>油.前者是后者的三倍.也就是說,GmFAD3A擁有300倍于GmFAD3C的表達量,卻只有3倍于GmFAD3C的α-亞麻酸貢獻量.由此可以推測,相同量的GmFAD3C與GmFAD3A的α-亞麻酸貢獻量之比為100/1,因此GmFAD3C比GmFAD3A的活性要強的多,GmFAD3C分子比GmFAD

6、3A分子更穩(wěn)定.在大豆種子中,活性很高的GmFAD3C表達量很低,而活性極低的GmFAD3A表達量卻極高.植物主要靠過量表達一個活性低的ω-3脂肪酸脫氫酶來貢獻α-亞麻酸,而不是稍微多表達一點 GmFAD3C.這其中的機制尚待進一步研究.因此本試驗采用活性較高的GmFAD3C基因,在其表達后能夠更容易分析花生中脂肪酸含量的變化. 本實驗用RT-PCR.方法從大豆未成熟種子中擴增出GmFAD3C的cDNA,連入pUCm-T,得pU

7、GFAD3C.最后連接到植物表達載體pROKII中,建成了pROK-Ⅱ.FAD3C重組載體,轉化到農桿菌EHA105中,通過農桿菌介導轉化花生豐花3號,用胚軸和子葉作為外植體,經過比較后發(fā)現胚軸作為外植體較為優(yōu)異,由此建立了豐花3號的遺傳轉化體系.經過卡那霉素的篩選得到抗性苗,提取抗性苗的基因組DNA,用PCR以及PCR southern鑒定出了轉基因植株.一方面通過氣相色譜分析花生脂肪酸成份的變化可以進一步證明GmFAD3C的功能,另