反油酸誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞凋亡作用機制的研究.pdf

1、反式脂肪酸(trans fatty acid，TFA)是一類存在于加工油脂和含油脂類加工食品中的常見組成成分。目前已經(jīng)有很多關(guān)于TFA和心腦血管疾病關(guān)系的報道，顯示了TFA與心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，但對于其具體致病的作用機制尚不明確。內(nèi)皮細胞功能障礙是動脈粥樣硬化(AS)及其他很多心腦血管疾病發(fā)病的初始環(huán)節(jié)，在AS發(fā)病過程中占有重要地位。內(nèi)皮細胞周期阻滯以及內(nèi)皮細胞的不正常凋亡是導(dǎo)致內(nèi)皮細胞功能障礙的重要激發(fā)因素，在AS發(fā)

2、生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的推動作用。
　　 目前世界上針對TFA對AS及其他心腦血管疾病的研究主要聚焦于內(nèi)皮細胞功能障礙和內(nèi)皮細胞過度凋亡兩個方面上，并且研究的大多是反式脂肪酸的混合物，很少有針對單個種類的反式脂肪酸對AS和心腦血管疾病的影響研究。鑒于我國居民日益增多的TFA攝入量以及我國關(guān)于TFA與人體健康研究甚少的現(xiàn)狀，研究TFA對AS的影響及其作用機制具有明顯的理論價值和社會意義。本課題針對反油酸研究其與AS及心腦血管疾病的

3、關(guān)系，主要通過反油酸對臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)功能障礙和內(nèi)皮細胞周期及凋亡的影響，來探討反油酸通過p53介導(dǎo)的細胞凋亡致動脈粥樣硬化的機制，為反式脂肪酸與心腦血管疾病的關(guān)系以及心血管疾病的防治提供重要理論依據(jù)和科學(xué)數(shù)據(jù)。
　　 本研究通過ELISA法檢測了反油酸作用前后細胞培養(yǎng)液中P-選凝素、sICAM-1、TNF-α、ET-1、TXA-2、PGI2等內(nèi)皮細胞功能障礙指標的變化，確定不同濃度的TFA對內(nèi)皮細胞功能障礙的影響;

4、采用流式細胞儀測定TFA對內(nèi)皮細胞凋亡率的影響;通過Western-blot檢測反油酸作用前后內(nèi)皮細胞中與細胞周期和凋亡有關(guān)的CDK4和PA28γ的變化;利用RT-PCR檢測TFA作用前后細胞中p21、p53、Bcl-2、CDK4、CyclinD1、PA28γ等周期凋亡相關(guān)蛋白mRNA表達的變化，定量檢測TFA對內(nèi)皮細胞功能障礙和細胞周期、凋亡的影響，探討反油酸通過p53介導(dǎo)的細胞凋亡致動脈粥樣硬化的機制。得到的結(jié)果如下:
　　

5、 1.TFA能使細胞功能障礙的生物學(xué)指標P-選凝素、sICAM-1、ET-1、TXA-2及TNF-α的分泌升高，PGI2分泌降低。P-選凝素和sICAM-1的大量分泌會引起微血管內(nèi)皮細胞與中性粒細胞黏附，致使白細胞穿出微血管壁，引起局部組織炎癥反應(yīng)，TNF-α分泌升高，易加劇炎癥反應(yīng)，抗炎因子與促炎因子調(diào)節(jié)失衡，引起全身炎癥反應(yīng)綜合征，進而造成全身多器官功能障礙。ET-1升高可造成局部微循環(huán)障礙，促進血栓形成，加速了炎癥反應(yīng)和AS的進程

6、。同時，ET-1升高可以抑制PGI2的合成和釋放，同時促進TXA-2的分泌，導(dǎo)致PGI2/TXA-2調(diào)節(jié)失衡，增加血管張力的，血液處于高凝狀態(tài)，從而增加了心腦血管并發(fā)癥的發(fā)生率。各種指標表明，TFA能夠造成內(nèi)皮細胞功能障礙。
　　 2.TFA作用后，HUVEC細胞凋亡率增加，高濃度的反油酸對細胞凋亡影響較大，早期凋亡率和晚期凋亡率均有大幅度提高，低濃度的反油酸也使細胞凋亡率升高，但影響不大。
　　 3.Western-b

7、lot檢測結(jié)果顯示，TFA作用后，內(nèi)皮細胞中CDK4表達明顯下降，且作用呈劑量依賴性，CDK4下降，使細胞滯留在G0/G1期，降低S和G2/M期細胞比例，阻斷了細胞周期的進行，加速細胞凋亡。PA28γ，表達下降，減弱了Mdm2對p53的負反饋作用，阻礙了p53的降解，使細胞在G1停滯，DNA損傷無法修復(fù)，使細胞凋亡。結(jié)果表明，TFA可以導(dǎo)致細胞周期停滯和加速細胞凋亡。
　　 4.通過RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)反油酸能夠升高細胞內(nèi)p2

8、1、p53的mRNA相對表達量，降低Bcl-2、CDK4、CyclinD1、PA28γ的mRNA相對表達量，并與反油酸濃度相關(guān)。PA28γ降低，致使P53表達升高，增強了對Bcl-2的抑制，降低了Bcl-2抑制凋亡的作用，激活了Caspase9，進而激活Caspase3，出現(xiàn)細胞凋亡。p53表達升高又增加了轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物p21的表達，使CDK4、CyclinD1下降，減弱了CDK4/CyclinD1對G1向S期轉(zhuǎn)變的調(diào)控，導(dǎo)致G1期阻滯，使細

9、胞不能完成正常的有絲分裂，導(dǎo)致細胞凋亡。這說明反油酸即可以通過激活p53，進而激活p21，來誘導(dǎo)細胞周期阻滯導(dǎo)致細胞死亡，又可以通過激活p53，進而激活Bcl-2蛋白激活線粒體通路，最終導(dǎo)致細胞凋亡。
　　 綜上所述，TFA能夠通過上調(diào)內(nèi)皮細胞分泌的各類炎癥因子和細胞因子造成內(nèi)皮細胞損傷導(dǎo)致內(nèi)皮細胞功能障礙，促進炎癥反應(yīng)進程，并且TFA能夠上調(diào)內(nèi)皮細胞周期及凋亡相關(guān)蛋白的mRNA表達，通過p53介導(dǎo)的內(nèi)皮細胞凋亡和細胞阻滯通路誘