mTOR信號通路調(diào)控豬瘟病毒復(fù)制的機制研究.pdf

1、豬瘟(Classical swine fever, CSF)是由豬瘟病毒（Classicalswine fever virus，CSFV）引起的一種以高熱、出血和免疫抑制為典型特征的嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的重大傳染病，是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的必須報告的疫病，對我國乃至全球的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。CSFV屬于黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬(Pestivirus)，是一種單股正鏈RNA病毒。目前對CSFV的致病機制雖有一

2、定的研究，但對于CSFV在宿主細胞中感染復(fù)制的機制，以及免疫逃逸的致病機理仍缺乏全面深入的了解。由于病毒要建立持續(xù)性感染，必須利用宿主細胞中可調(diào)控蛋白合成、能量代謝、細胞存活生長的關(guān)鍵信號通路。因此，探討CSFV感染的宿主細胞中參與調(diào)控細胞存活、蛋白合成和細胞自噬等過程的關(guān)鍵信號通路，闡明其參與CSFV復(fù)制增殖的機制，為豬瘟的防治提供新的靶點和理論依據(jù)。
　　哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapa

3、mycin，mTOR)信號通路連接著從感應(yīng)能量和生長因子到調(diào)控細胞存活生長及大分子合成代謝的過程，除了在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，也參與多種DNA、RNA病毒的感染復(fù)制，在病毒復(fù)制中扮演重要的角色。但對于CSFV與mTOR信號通路的關(guān)系，目前尚沒有明確報道。因此，本研究擬闡明CSFV對mTOR信號通路的調(diào)控，以及mTOR信號通路調(diào)控CSFV復(fù)制的分子機制，從mTOR的角度為解釋CSFV的復(fù)制和持續(xù)性感染提供新的理論依據(jù)。
　　

4、本研究首先利用細胞內(nèi)信號通路蛋白芯片技術(shù)以及western-blot等方法證實與未感染CSFV的細胞相比較，CSFV（石門強毒株）感染ST細胞能夠顯著抑制Akt/mTOR信號通路的激活，該抑制在6-24 h最為顯著，隨后逐漸恢復(fù)，至48h恢復(fù)至處理前水平。而CSFV結(jié)構(gòu)蛋白Erns、非結(jié)構(gòu)蛋白NS3、NS5A在抑制Akt/mTOR信號通路的激活中發(fā)揮重要的作用。為了探討Akt/mTOR信號通路對CSFV自身復(fù)制的影響，利用mTOR抑制劑

5、rapamycin和激活劑insulin改變宿主細胞mTOR通路活性后感染CSFV，western-blot和熒光定量PCR等結(jié)果表明在24 h內(nèi)，rapamycin雖抑制細胞增殖但顯著促進CSFV的復(fù)制;而insulin促進細胞增殖但顯著抑制CSFV復(fù)制;值得注意的是在48 h時這一調(diào)控趨勢并不存在;我們推測:CSFV感染抑制mTOR/S6K1，導(dǎo)致S6K1通過IRS（胰島素受體）誘導(dǎo)Akt負反饋激活，進而抵消了由mTOR抑制引起的病

6、毒復(fù)制。隨后，我們進一步探討mTOR上游Akt對CSFV復(fù)制的影響;分別應(yīng)用Akt特異性抑制劑(LY294002)抑制Akt活性，以及Akt激活劑(SC79)激活A(yù)kt后感染CSFV，熒光定量PCR結(jié)果表明，與未經(jīng)處理的ST細胞相比較，抑制Akt活性能夠在72 h內(nèi)持續(xù)上調(diào)CSFV基因組拷貝數(shù);而激活A(yù)kt則持續(xù)降低CSFV基因組拷貝數(shù)。與單獨改變mTOR活性引起的只在24 h內(nèi)調(diào)控病毒復(fù)制有所不同，這很有可能是由于CSFV感染引起mT

7、OR抑制誘導(dǎo)Akt負反饋激活以及Akt作為mTOR上游引起比mTOR更強的作用導(dǎo)致。上述研究結(jié)果表明Akt/mTOR信號通路可負調(diào)控CSFV的復(fù)制，也提示CSFV感染ST細胞可能通過誘導(dǎo)Akt負反饋激活來調(diào)控病毒復(fù)制和維持細胞穩(wěn)態(tài)。
　　為了深入探究Akt/mTOR信號通路負調(diào)控CSFV復(fù)制的分子機制，本研究以mTOR信號通路下游調(diào)控自噬及蛋白合成的兩個效應(yīng)分子ULK1和S6K1為切入點，應(yīng)用透射電鏡、western-blot、共

8、聚焦顯微鏡、LC3雙熒光自噬慢病毒、IFA檢測病毒滴度以及熒光定量PCR等方法證明CSFV感染能夠增強ST細胞的自噬流，隨后應(yīng)用rapamycin和insulin以及ULK1抑制劑抑制或激活mTOR/ULK1活性，結(jié)果顯示自噬被顯著促進或抑制，而病毒的復(fù)制被相應(yīng)的促進或抑制。證明CSFV通過mTOR/ULK1依賴的信號通路誘導(dǎo)細胞自噬進而促進病毒復(fù)制。另一方面，應(yīng)用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)，通過構(gòu)建含CSFV內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)

9、的螢火蟲熒光素酶重組載體(CSFV-IRES)，應(yīng)用過表達和shRNA干擾等方法證明過表達和干擾表達S6K1能夠抑制和促進CSFV-IRES蛋白驅(qū)動活性，隨后病毒滴度檢測和熒光定量PCR結(jié)果顯示，過表達和干擾表達S6K1能抑制和促進CSFV復(fù)制。接著，利用免疫共沉淀、核糖體分離技術(shù)以及熒光定量PCR等方法證實，CSFV感染ST細胞能抑制mTOR/S6K1磷酸化激活，進而促進S6K1與真核起始因子3(eIF3A)的結(jié)合，釋放CSFV-IR

10、ES與eIF3競爭結(jié)合40S核糖體，促進病毒mRNA翻譯。
　　Akt/mTOR信號通路抑制能夠?qū)е录毎鲋骋种坪图毎蛲觯隗w外，CSFV感染宿主細胞通常不抑制細胞增殖和凋亡。因此結(jié)合以上的研究，我們探討CSFV感染抑制Akt/mTOR信號通路是否通過誘導(dǎo)Akt負反饋維持細胞增殖和抗凋亡，以便于為病毒復(fù)制提供穩(wěn)定的細胞內(nèi)環(huán)境。通過western-blot檢測CSFV感染后Akt磷酸化水平，結(jié)果表明Akt磷酸化水平先降低后恢復(fù)，

11、進一步證實CSFV感染ST細胞可誘導(dǎo)Akt負反饋激活。隨后流式細胞檢測發(fā)現(xiàn)CSFV感染初期能夠?qū)⒓毎芷谧铚贕0/G1期，而48 h后沒有阻滯作用;另外使用Akt抑制劑LY294002單獨或與CSFV共同作用ST細胞，SRB實驗檢測細胞增殖，結(jié)果顯示抑制Akt活性同時感染CSFV較單獨抑制Akt或單獨感染CSFV時，對細胞增殖的抑制顯著增強，間接提示CSFV感染誘導(dǎo)宿主細胞Akt負反饋激活，維持宿主細胞增殖，而一旦Akt被抑制劑持續(xù)抑

12、制，感染CSFV誘導(dǎo)的Akt負反饋激活也被相應(yīng)地抑制，因此不能維持細胞增殖。接著，細胞凋亡檢測結(jié)果顯示，抑制Akt活性同時感染CSFV較單獨抑制Akt或單獨感染CSFV時對細胞引起的凋亡率更大，證明CSFV誘導(dǎo)的負反饋激活能夠維持細胞存活。最后，以Akt抑制劑與CSFV共同作用ST細胞至24 h、48h、72 h，熒光定量PCR檢測結(jié)果表明，與單獨感染CSFV細胞相比較，在72 h內(nèi)持續(xù)阻斷Akt能夠持續(xù)上調(diào)病毒基因組拷貝數(shù)，進一步提示