剪應力和血管內皮生長因子對人骨髓間充質干細胞向血管內皮細胞分化的影響.pdf

1、研究背景：
　　治療性血管新生即將外源性的血管生成細胞或血管生成因子導入缺血組織中，促進局部的血管新生和側枝循環(huán)形成,從而達到治療缺血性疾病的目的，是近年來提出的治療缺血性疾病特別是缺血性心臟病的新概念。目前的研究主要集中于選擇何種血管生成細胞及如何獲得足夠數(shù)量的細胞以保證最佳的治療效果，干細胞是血管生成細胞重要的來源。
　　骨髓間充質干細胞（MSCs）是一類存在于骨髓基質內的非造血干細胞來源的細胞亞群。MSCs具有容易分離

2、培養(yǎng)、多向分化能力、免疫排斥反應小的特點，已經(jīng)成為構建組織工程十分重要的種子細胞。MSCs生長的生物化學環(huán)境和復雜的生物力學環(huán)境對其分化和表型表達有重要的影響。MSCs可以在體外擴增并可經(jīng)不同條件誘導后分化為內皮細胞、成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌細胞、神經(jīng)細胞等多種細胞。而內皮細胞是導致血管新生的重要細胞，在體外血管內皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、IGF-1、ECGS等細胞因子單獨或聯(lián)合的誘導下MSCs

3、可以向內皮細胞分化，使其成為一種可能用于治療性血管新生的細胞來源。此外，因其體外可大量擴增，有望解決血管內皮細胞來源不足的問題。但各種細胞因子普遍價格昂貴，以及潛在的細胞生物安全性問題未得到解決。而相對細胞因子的化學環(huán)境，生物力學環(huán)境對MSCs影響的研究仍處于起步階段。血流剪應力是血管內皮細胞成熟并保持功能的不可缺少的促進因素，已有研究表明[8]，剪應力可以誘導了胚胎干細胞和內皮祖細胞兩類干細胞向內皮細胞分化。因此提示剪應力也可能誘導M

4、SCs向內皮細胞分化。
　　目的：
　　本研究擬探討在體外培養(yǎng)的條件下，VEGF和剪應力對人MSCs向內皮細胞分化的影響。
　　方法：
　　第一部分MSCs的分離培養(yǎng)和鑒定
　　1.取健康成人骨髓，密度梯度離心結合貼壁法分離MSCs，體外培養(yǎng)并傳代。
　　2.光鏡下觀察細胞形態(tài)。
　　3.用免疫組織化學法檢測細胞表面標記物CD44對MSCs進行鑒定。
　　第二部分VEGF對MSCs向內皮細

5、胞分化的影響
　　將培養(yǎng)得到的MSCs分為對照組和VEGF誘導組，誘導組給予10μg/LVEGF作用。分別于誘導24小時（h）、7天（d）后觀察細胞形態(tài)變化，采用間接免疫熒光染色法檢測內皮細胞標記物VonWillebrandfactor(vWF)的表達情況，用Dil標記的乙?；疞DL（Dil-Ac-LDL）攝取實驗檢測內皮細胞脂質攝取功能。
　　第三部分剪應力對MSCs向內皮細胞分化的影響
　　將培養(yǎng)得到的MSCs分為

6、對照組和剪應力誘導組（8、15dyn/cm2），誘導組在平行平板流動腔裝置中施加剪應力。誘導24h后觀察細胞形態(tài)變化、vWF表達情況以及Dil-Ac-LDL攝取功能。
　　第四部分剪應力聯(lián)合VEGF對MSCs向內皮細胞分化的影響
　　將培養(yǎng)得到的MSCs分為對照組、剪應力聯(lián)合誘導組（8、15dyn/cm2）與VEGF（10μg/L）聯(lián)合誘導組。誘導24h后觀察細胞形態(tài)變化，vWF表達情況以及Dil-Ac-LDL攝取功能。

7、r>　　結果：
　　1.分離培養(yǎng)得到的MSCs形態(tài)呈長梭形，免疫組化染色顯示CD44陽性，證明培養(yǎng)細胞為MSCs。
　　2.與對照組相比，VEGF誘導24h后MSCs形態(tài)無明顯變化，vWF染色陰性，Dil-Ac-LDL攝取實驗陰性。VEGF誘導7d后MSCs形態(tài)呈扁圓或多角形，類似內皮細胞，vWF染色陽性，Dil-Ac-LDL攝取實驗陽性，提示MSCs已分化為內皮細胞。
　　3.與對照組相比，8dyn/cm2剪應力作用

8、24h后，MSCs呈扁圓或多角形，vWF染色弱陽性，Dil-Ac-LDL攝取實驗陽性，提示MSCs已分化為內皮細胞。而15dyn/cm2剪應力作用24h后，vWF染色與Dil-Ac-LDL攝取實驗均陰性，提示MSCs未向內皮細胞分化。
　　4.與單獨剪應力作用組相比，剪應力與VEGF聯(lián)合作用24h后，細胞密度明顯增大，vWF染色強陽性，Dil-Ac-LDL攝取實驗陽性，提示MSCs不僅分化為內皮細胞，而且發(fā)生增殖。
　　結論