轉染GDF-5的BMSC自體移植與應用GAM對延緩椎間盤退變療效的比較.pdf

1、目的：
　　 腰椎間盤突出癥是骨科的常見病和多發(fā)病,也是腰腿痛的主要因為,嚴重影響了人們的生活質量,并且丟失大量的社會勞動力,給社會帶來沉重的負擔。一般認為椎間盤突出是在椎間盤退變的基礎上發(fā)生的,其共同特征是髓核內蛋白多糖含量的減少,因此可以通過生長因子刺激髓核細胞增加蛋白多糖的合成,減少分解來緩解甚至逆轉退變的過程。
　　 隨著基因強化組織工程學的發(fā)展,對椎間盤退變進行分子水平上的治療成為可能,本實驗通過采用基因治療的

2、兩種方法:干細胞體外基因修飾和直接體內轉染椎間盤細胞,使其在髓核組織內持續(xù)表達GDF-5,來對延緩椎間盤退變的效果進行比較,以期為臨床應用基因療法治療椎間盤退變提供依據(jù)。
　　 方法：
　　 (一)經超順磁性氧化鐵標記的自體BMSCs在兔椎間盤內存活時間的研究
　　 1、兔BMSCs分離培養(yǎng)及檢測
　　 采用密度梯度離心法,分離、純化兔骨髓間充質干細胞,進行體外培養(yǎng)擴增,并進行細胞形態(tài)學、組織化學染色觀察

3、。
　　 2、SPIO標記兔BMSCs及檢測
　　 取第三代原代培養(yǎng)細胞,采用SPIO-PLL復合物標記細胞,并進行細胞普魯士藍鐵染色、透射電鏡檢測是否標記成功,MTT法測定標記細胞增殖是否受到影響。
　　 3、標記細胞在椎間盤內存活時間的研究
　　 實驗組和對照組分別注入經SPIO標記和未標記的BMSCs懸液,術后2、4、6、8周,實驗組和對照組分另0取相應椎間盤行普魯士藍鐵染色,鏡下觀察在細胞質內是否

4、出現(xiàn)藍染顆粒。
　　 (二)體內體外兩種轉染方法對延緩椎間盤退變效果的比較研究
　　 1、脂質體介導的pcDNA3.1(+)/GDF-5重組質粒轉染BMSC用倒置顯微鏡觀察細胞的生長情況和形態(tài)學變化。
　　 2、基因活化基質的制備
　　 Ⅰ型膠原支架切成直徑1mm長5mm的長條經環(huán)氧乙烷消毒后備用,按步驟2的比列稀釋質粒和脂質體,將支架放入其中浸泡30min后進行動物手術。
　　 3、動物手術后2

5、個月椎間盤退變修復效果檢測
　　 取術后2個月各組兔椎間盤的髓核,間苯三酚法測蛋白多糖含量,流式細胞儀檢測凋亡率。
　　 結果：
　　 (一)兔BMSCs其自體椎間盤中可以持續(xù)存活8周
　　 1、剛接種BMSCs的培養(yǎng)瓶中為大量圓形細胞,2～3 d出現(xiàn)少數(shù)長梭形細胞；5～7 d后圓形細胞消失,長梭形細胞數(shù)量逐漸增多,成簇生長,呈放射狀排列；10～20 d開始呈對數(shù)生長。傳至第3代時細胞呈漩渦樣生長,掃描電

6、鏡顯示第3代細胞表面有大量微絨毛,糖原染色呈強陽性,Col Ⅰ、ALP及脂肪染色均呈陰性。
　　 2、經普魯士藍鐵染色顯示陽性細胞胞質內出現(xiàn)藍染顆粒,透射電鏡觀察顯示胞質內有電子高密度鐵顆粒,MTT檢測顯示7 d內未標記細胞組和SPIO標記細胞組間細胞增殖比較差異無統(tǒng)計學意義。
　　 3、術后2周,實驗組鏡下可見髓核中有大量藍染顆粒,且位于胞質內；4周,髓核和纖維環(huán)均可見到位于細胞質內的藍染顆粒；6、8周,仍可觀見位于胞

7、質內的藍染顆粒。各時間點對照組椎間盤切片均未觀察到藍染顆粒。
　　 (二)體內體外兩種轉染方法對延緩椎間盤退變效果的比較研究
　　 1、轉染12小時后可見部分細胞出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象,48小時后細胞生長良好,體積略增大。
　　 2、轉染48小時后各組細胞以及手術后2個月各組椎間盤RTPCR結果如圖,pcDNA3.1(+)/GDF-5轉染細胞組,回輸轉染MSC組和GAM組的髓核均在約560bp處有電泳條帶,轉染成功。