長期乙醇攝入對大鼠胃黏膜上皮細胞免疫因子TSLP表達的研究.pdf

1、第一部分:大鼠胃黏膜上皮氧化應激狀態(tài)的建立及機制。
　　研究背景:
　　大量飲酒與胃腸道疾病相關，長期適量飲酒對胃腸道的影響尚待研究。
　　高濃度乙醇對胃黏膜損害的動物模型較為容易建立，長期適量乙醇攝入對胃黏膜的影響的動物模型鮮有報道。
　　Benjiamin Taylor[7]通過系統(tǒng)性回顧研究對于長期適度飲酒對胃腸的作用和影響得出結論:適量的乙醇攝入對于疾病發(fā)展起消極、積極的作用，總得來說適量乙醇攝入不是胃腸

2、疾病發(fā)展的高危因素。Taylor B把適量飲酒定義為每天乙醇攝入約為10-40g/d，據此我們給予Wistar大鼠乙醇15％(V/V)1ml/d灌胃，相對于適量攝入乙醇量。
　　流行病學研究[8]表明適量飲酒是肝病、食管腫瘤、胰腺炎的危險因素，但是對于慢性胃炎、膽囊結石卻有積極意義，機制并不明確。人體中95％左右乙醇分解是通過氧化途徑進行，包括乙醇的首過代謝(first-pass metabolism，FPM)，微粒體乙醇氧化體系

3、(microsomal ethanol-oxidizing system，MEOS)，脂肪酸過氧化氫酶(catalase)，乙醛脫氫酶(aldehydede hydrogenase，ALDH)[9]。乙醇首過代謝[10]是指一定量的乙醇攝入后進入系統(tǒng)循環(huán)之前在胃和肝中代謝。Lieber[11]等廣泛的研究了這種現象，他們提出FPM主要發(fā)生在胃組織，胃黏膜乙醇脫氫酶起重要作用。ADH和ALDH途徑是乙醇代謝的主要途徑，ADH介導乙醇氧化，

4、使底物乙醇上的氫轉移到輔酶NAD上，轉化為NADH，產生底物乙醛。乙醛利用輔酶NAD在ALDH作用下轉化為乙酸，產生NADH。乙酸轉化為乙酰輔酶A，進入三羧酸循環(huán)，最終分解為二氧化碳和水。
　　隨著酒精攝入量的增加和蓄積微粒體乙醇氧化系統(tǒng)參與乙醇氧化代謝，活性氧(reactive oxygen species，ROS)、氧自由基(oxygen free radical，OFR)隨之產生，包括線粒體在內的細胞膜性系統(tǒng)出現脂質過氧化，

5、細胞進入氧化應激(oxidative stress，OS)狀態(tài)[12]，轉錄因子缺氧誘導因子-1a表達增加，從而引起細胞處于乏氧適應狀態(tài)，以及新的功能。而免疫功能也會發(fā)生改變，以適應細胞內低氧的環(huán)境。
　　1992年，Semenza，Wang首先發(fā)現了HIF1蛋白。HIF1是異源二聚體蛋白，由HIF1-α和HIF1-β組成，在缺氧條件下HIF1α迅速表達。一旦激活，HIF1α加強基因轉錄，包括幾乎所有的參與糖酵解的酶，增強細胞糖酵

6、解能力[13]。HIF1α激活丙酮酸脫氫酶激酶，抑制線粒體丙酮酸脫氫酶復合體，減少進入三羧酸循環(huán)的丙酮酸量。進入三羧酸循環(huán)的丙酮酸減少，減少缺氧狀態(tài)下氧化磷酸化及氧耗量。
　　HIF1α參與免疫的調節(jié)。
　　胸腺基質淋巴細胞生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)源于細胞上皮的一種淋巴因子，可以直接作用于黏膜中樹突細胞(dendritic cells，DCs)[14，15]。使后者分泌OX

7、40L促使TH0細胞向TH2細胞極化，形成TH2免疫。
　　正常胃黏膜上皮中存在DCs。TSLP是抗炎因子。
　　TSLP是否在正常胃黏膜中表達，尚未有研究。
　　目的與方法:
　　我們研究長期乙醇攝入后大鼠胃黏膜病理形態(tài)變化，胃黏膜丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量變化及胃黏膜損傷程度，探討胃黏膜上皮細胞在缺氧狀態(tài)下，脂質過氧化與上皮損傷的關系。我們分別用15％、30％、45％不同濃度乙醇灌胃

8、制備胃黏膜上皮氧化狀態(tài)模型，觀察胃黏膜大體及鏡下形態(tài)學變化并評估黏膜損傷指數(lesion index，LI)，硫代巴比妥酸法(thiobarbituric acid，TBA)測定胃黏膜內MDA含量，MDA與LI、病理損傷積分的關系。
　　結果:
　　我們發(fā)現(1)15％乙醇攝入組，3、6、9周后黏膜損傷指數、病理損傷積分、及MDA數量分別與對照組相比，均沒有顯著變化。(P＞0.05，n=9)(2)30％、45％組胃黏膜損傷

9、指數與胃黏膜MDA含量呈正相關，隨著乙醇濃度的升高及作用時間的延長，胃黏膜MDA含量增加，胃黏膜損傷程度加重(p＜0.01，n=9)。
　　結論:
　　對于大鼠5ml/kg/d15％v/v乙醇攝入后，大鼠胃黏膜上皮細胞氧化應激狀態(tài)不明顯。
　　隨著濃度升高、攝入時間延長，長期乙醇攝入可引起胃黏膜上皮細胞脂質過氧化，細胞整體上處于缺氧狀態(tài)。
　　第二部分:氧化應激狀態(tài)下大鼠胃黏膜上皮細胞免疫因子表達的研究。

10、　　研究背景:
　　細胞內物質代謝與細胞免疫是細胞內兩種不同的功能。乙醇在胃黏膜上皮細胞代謝后是否能夠影響胃黏膜上皮細胞的功能，尚未有研究。
　　乙醇與胃黏膜的關系主要集中于損傷與修復的關系。
　　長期乙醇攝入經過胃黏膜上皮的首過代謝作用、微粒體乙醇氧化系統(tǒng)作用，胃黏膜上皮細胞細胞膜出現脂質過氧化及大量活性氧產生，細胞內固有還原劑NADPH減少，細胞為適應常氧到缺氧環(huán)境的變化，轉錄因子缺氧誘導因子-1alpha(HIF

11、-1α)功能增強，增強細胞缺氧耐受。HIF-1α是1992年發(fā)現的一種重要轉綠因子，HIF-1α的下游靶基因目前有超過200個，參與能量代謝、血管新生、一氧化氮合成、鐵與血紅素代謝以及免疫調節(jié)[27]。胸腺基質淋巴細胞生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)是一種上皮細胞來源的細胞因子，作用于髓樣和淋巴樣樹突細胞，調節(jié)適應性免疫，在起始和促進Th2細胞免疫過程中起重要作用。TSLP與樹突細胞上TSLP

12、R直接作用，通過CD40L促使Th0極化為Th2細胞，形成體液免疫，參與對胞外菌及寄生蟲清除。其激活途徑是獨立于MCHII分子、共刺激分子之外的另一條途徑。TSLP是否在胃黏膜上皮中表達，以及其表達的機制尚未有人研究。我們設想在長期乙醇攝入條件下HIF-1α被激活，其靶基因TSLP表達。豐富黏膜免疫理論，為適量飲酒可以有助于清除幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori，HP)提供理論支持。
　　目的:
　　1.建

13、立適量飲酒的大鼠動物模型。
　　2.大鼠胃胃黏膜上皮能否表達TSLP，以及表達量是否與攝入乙醇量、時間有關系。
　　3.轉錄因子HIF-1α是否調控TSLP表達。
　　材料與方法:
　　選用健康雄性Wistar大鼠33只，按照不同濃度分為3組，分別給予生理鹽水、15％、45％乙醇灌胃，8％水合氯醛1ml麻醉后給予取出胃黏膜，用RT-PCR檢查各組HIF-1α、TSLPmRNA相對表達量，免疫組化進行蛋白定位，We

14、sternblot技術測定細胞內HIF-1α、TSLP表達量并進行相關性分析。
　　統(tǒng)計方法:
　　SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，數據以均數±標準差表示，采用單因素方差分析進行統(tǒng)計學處理，以P＜0.05為顯著性差異。
　　實驗結果
　　生理鹽水組大鼠胃黏膜mRNA水平檢測到HIF-1α，未檢測到TSLP。蛋白質水平未檢測到HIF-1a、TSLP。15％，45％組mRNA水平、蛋白質水平均有HIF-1α、TSL