TGF-β、MMPs和TIMPs在風濕性心臟病二尖瓣狹窄合并持續(xù)性房顫中的作用.pdf

1、目的及意義：
　　急性風濕熱侵犯心臟后遺留的慢性心臟病變最終導致風濕性心臟病(RheumaticHeart Disease，RHD)，風濕熱是變態(tài)反應性疾病，常侵犯心臟引起全心炎，累及心包、心肌及心內(nèi)膜。風濕熱反復發(fā)作的損害最嚴重的是造成心內(nèi)膜損傷，特別是二尖瓣的心內(nèi)膜組織。長期反復炎性反應和血流動力學改變產(chǎn)生的機械性損傷和血小板聚積產(chǎn)生的二尖瓣病變主要有瓣膜交界融合，瓣葉纖維化增厚，腱索及/或乳頭肌纖維化縮短、融合和瓣葉鈣化。心

2、房纖顫是臨床上較為普遍的一種心律失常，心房纖顫時可加重風濕性二尖瓣瓣膜狹窄的程度。房顫對心臟瓣膜的破壞主要表現(xiàn)在細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)正常結構的破壞是房顫對心臟瓣膜破壞的主要表現(xiàn)，表現(xiàn)為比例失調(diào)和排列紊亂的各型膠原，以及沉積增多?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)與金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitors of metalloprotei

3、nases，TIMPs)兩者均為影響細胞外基質(zhì)代謝最關鍵的酶類。心房纖顫時MMPs、TIMPs平衡失調(diào)使心臟瓣膜破壞，Ⅰ型和Ⅲ型排列紊亂，膠原沉積增多。MMP-2，MMP-9和TIMP-2是心房纖顫發(fā)生后，MMP和TIMP中表達最具有意義的指標。轉化生長因子TGF-β通過對MMP和TIMP家族成員因細胞類型而異的基因表達調(diào)控作用，表現(xiàn)出調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)重建的生物學效應。本研究分兩部分，第

4、一部分對病變二尖瓣標本行常規(guī)組織學檢查，及HE、Masson染色，觀察病變二尖瓣標本病理改變，定量的計算膠原容積分數(shù)(CVF)以反映二尖瓣的纖維化程度，明確瓣膜結構重構的表現(xiàn)。對Ⅰ型和Ⅲ型膠原進行免疫組化染色，分析兩種膠原在二尖瓣纖維化時的不同表現(xiàn)。第二部分意在了解TGF-β、MMPs及TIMPs在合并房顫的風濕性二尖瓣狹窄病變組織中的表達狀態(tài)在對照組及實驗組有無顯著性差異，進而反映TGF-β，MMPs，TIMPs在二尖瓣重構中的重要作

5、用。
　　材料和方法：
　　本課題分為組織病理學實驗及逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)實驗兩部分。
　　一、組織病理學實驗
　　選在解放軍總醫(yī)院行MVR的風心病二尖瓣狹窄病人39例，其中24例為持續(xù)性房顫患者，設為實驗組，15例心律正?；颊?，設為對照組;組織標本應用HE、Masson染色和免疫組化染色行組織學的檢查，觀察二尖瓣組織的結構變化，采用分析軟件對細胞外CVF進行定量測定，對二尖瓣纖維化進行評估，確定

6、其結構重構表現(xiàn)。對Ⅰ型和Ⅲ型膠原進行免疫組化染色，分析兩種膠原在二尖瓣纖維化時的不同表現(xiàn)。采取免疫組織化學染色(SP法)對實驗組和對照組二尖瓣組織中TGF-β1、MMP-2、MMP-9、TIMP-2行染色，普通光鏡觀察后用高清晰度病理圖像分析系統(tǒng)采集圖像，對MMP-2、MMP-9、TIMP-2的蛋白表達水平行積分光密度(IOD)測定，取平均值為量化指標，對比兩組MMP-2、MMP-9、TIMP-2的蛋白表達水平。
　　二、逆轉錄-

7、聚合酶鏈反應(RT-PCR)實驗
　　采取RT-PCR技術測定兩組MMP-2、MMP-9、TIMP-2、TGF-β1的mRNA表達水平，PCR的擴增產(chǎn)物電泳圖像測定的目的基因與β-actin基因電泳條帶的灰度積分，以二者的比值表示目的基因mRNA含量。明確二尖瓣結構重構時TGF-β1、MMP-2、MMP-9、TIMP-2表達的改變。
　　實驗結果：
　　(1)兩組標本HE染色均顯示瓣膜的纖維組織明顯增生，膠原纖維玻璃樣

8、變性、明顯鈣化等。電子顯微鏡觀察示典型的RHD二尖瓣組織膠原纖維增生，并且伴有排列紊亂、斷裂。
　　(2) Masson染色發(fā)現(xiàn)，與竇性心律組比較，房顫組患者的二尖瓣組織平均細胞外膠原容積分數(shù)(CVF)顯著增大(P＜0.05)。
　　(3)免疫組織化學染色結果顯示二尖瓣組織的Ⅰ型膠原蛋白的表達增加(P＜0.05)，但是Ⅲ型膠原蛋白的表達無顯著差異。
　　(4)房顫組MMP-2、MMP-9的IOD值高于竇性心律組，TIM

9、P-2的IOD值低于竇性心律組且差異有統(tǒng)計學意義。
　　(5) RT-PCR結果顯示房顫組患者二尖瓣的TGF-β1、MMP-2，MMP-9的mRNA表達水平均顯著高于竇性心律組(t=3.051，P=0.020; t=3.024，P=0.012;t=2.725，P=0.019;)，TIMP-2的mRNA表達水平顯著低于竇性心律組(t=-2.310，P=0.018)。
　　(6)超聲心動圖檢測結果分析，房顫組與竇性心律組比較，前

10、者左房內(nèi)徑較后者顯著增大，且差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論：
　　1.風心病二尖瓣狹窄合并房顫組織標本結構細胞外基質(zhì)均存在明顯病理變化，即纖維組織增生，并且伴有排列紊亂、斷裂及鈣化。
　　2.風心病二尖瓣狹窄合并房顫組織中TGF-β1、MMP-2、MMP-9的mRNA表達水平及蛋白表達水平顯著增加，而TIMP-2的mRNA表達水平顯著低于竇性心律組，提示MMPs/TIMPs表達上調(diào)可能是RHD二尖瓣細胞外