維生素K2對血管鈣化和TOLL樣受體2及4表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　本研究通過在載脂蛋白E基因敲除（apoE-/-）小鼠及A7r5血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)上建立血管鈣化和細(xì)胞鈣化模型，給予維生素K2(Vitamin K2，VK2)干預(yù)，觀察VK2對小鼠斑塊組織及血管平滑肌細(xì)胞中鈣化的發(fā)生情況及Toll樣受體2（Toll-like receptor2，TLR2）、TLR4表達(dá)的影響。
　　方法：
　　本實(shí)驗(yàn)分為體內(nèi)

2、實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)兩部分，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過西方高脂飲食喂養(yǎng)誘導(dǎo)apoE-/-小鼠主動脈粥樣硬化斑塊(artherosclerosis，AS)并血管鈣化模型形成，體外實(shí)驗(yàn)以β-磷酸甘油誘導(dǎo)A7r5主動脈平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞鈣化，分別予維生素K2進(jìn)行干預(yù)，以蘇木精-伊紅(HE)染色分析小鼠主動脈AS斑塊組織形態(tài)學(xué)變化;von Kossa染色觀察小鼠主動脈及VSMCs鈣化發(fā)生情況;免疫組化和Western Blot檢測鈣化斑塊內(nèi)及VSMCs中TLR2、

3、TLR4蛋白表達(dá);實(shí)時定量PCR(qRT-PCR)檢測TLR2、TLR4 mRNA的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　(1)模型組apoE-/-小鼠主動脈HE染色可見內(nèi)膜顯著增厚，有典型的動脈粥樣硬化斑塊形成，內(nèi)皮細(xì)胞排列紊亂，平滑肌細(xì)胞增生明顯，細(xì)胞核大，內(nèi)膜和中膜增厚、部分彈力板變形、斷裂，纖維帽變薄，其下可見粉染的無定形物質(zhì)以及藍(lán)染的鈣鹽沉積，von Kossa染色可見斑塊纖維帽下灶狀黑色鈣化團(tuán)塊;VK2干預(yù)組小鼠主動脈可見

4、粥樣硬化斑塊，部分內(nèi)膜和中膜增厚，平滑肌細(xì)胞增生，彈力板變形，但von Kossa染色顯示斑塊內(nèi)未見顯著黑色鈣鹽沉積;對照組小鼠主動脈內(nèi)膜可見血管增厚不明顯，有早期動脈粥樣斑塊，但無內(nèi)彈力板破壞及鈣鹽沉積。
　　(2)鈣及堿性磷酸酶定量分析顯示，模型組小鼠主動脈血管壁組織鈣含量及堿性磷酸酶活性較正常對照組明顯升高(P＜0.01)，而干預(yù)組小鼠主動脈鈣含量和堿性磷酸酶活性均明顯低于模型組（P＜0.01）;
　　(3)免疫組織化

5、學(xué)染色顯示TLR2、TLR4主要表達(dá)于小鼠主動脈粥樣斑塊內(nèi)，模型組apoE-/-小鼠主動脈TLR2和TLR4蛋白水平表達(dá)較對照組小鼠都顯著增強(qiáng)，qRT-PCR證實(shí)模型組小鼠主動脈TLR2、TLR4 mRNA表達(dá)亦顯著高于對照組（P＜0.05），而干預(yù)組小鼠主動脈TLR2、TLR4 mRNA及蛋白表達(dá)較模型組均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。小鼠主動脈鈣含量與TLR2 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.77，P＜0.001），與T

6、LR4 mRNA表達(dá)亦呈正相關(guān)(r=0.79，P＜0.001)。
　　(4)用β-磷酸甘油可以成功誘導(dǎo)A7r5血管平滑肌細(xì)胞形成細(xì)胞鈣化，鈣化組細(xì)胞鈣含量及堿性磷酸酶活性較正常組細(xì)胞分別增加11.5倍和9.3倍，而維生素K2能夠抑制細(xì)胞鈣化的發(fā)生，同時較鈣化組分別降低細(xì)胞鈣含量及堿性磷酸酶活性1.5倍和2.3倍。
　　(5)β-磷酸甘油誘導(dǎo)的鈣化細(xì)胞中TLR2、TLR4 mRNA及蛋白表達(dá)水平升高，維生素K2可以降低TLR2

7、、TLR4的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　(1)高脂飲食能夠誘導(dǎo)apoE-/-小鼠發(fā)生血管鈣化，β-磷酸甘油能夠誘導(dǎo)A7r5血管平滑肌細(xì)胞形成鈣化，粥樣斑塊組織及細(xì)胞中的鈣化伴隨著TLR2、TLR4的表達(dá)升高。
　　(2)維生素K2可減輕apoE-/-小鼠及A7r5血管平滑肌細(xì)胞的血管鈣化，降低鈣含量和堿性磷酸酶活性并下調(diào)TLR2、TLR4 mRNA及蛋白的表達(dá)，提示維生素K2抑制血管鈣化的作用可能與TLR2、TLR4表達(dá)的