小鼠樹突狀細胞與骨髓瘤細胞融合瘤苗衍生exosomes的免疫效應研究.pdf

1、目前腫瘤治療方法主要有手術、化療、放療和生物治療。其中腫瘤生物治療是目前研究的熱點，具有良好的前景，樹突狀細胞(Dendritic Cell，DC)是腫瘤生物治療的重點研究對象。樹突狀細胞是目前己知功能最強的抗原提呈細胞(Antigen Presenting Cell，APC)，其在腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。本課題將DC與腫瘤細胞融合制成瘤苗，使該融合細胞即表達腫瘤抗原又具有提呈抗原的能力。
　　Exosomes為一種直徑30-12

2、0nm大小的囊泡狀物質，其中含有核酸和蛋白質。多種細胞已經(jīng)被證實在體外都能向細胞外釋放exosomes，包括:多種血細胞（B細胞、T細胞、樹突狀細胞、肥大細胞，血小板）、腸上皮細胞、施萬細胞（schwann，又名雪旺細胞）、脂肪細胞、神經(jīng)細胞、纖維母細胞和多種腫瘤細胞系[37-41]。目前在臨床和實驗研究中具有抗腫瘤作用的exosomes主要有兩種，一是腫瘤細胞產生的exosomes(Tumor Derived Exosomes，TEX

3、)，因其含有許多腫瘤細胞所共有的腫瘤抗原，具有潛在的加強腫瘤細胞免疫原性、促進抗腫瘤免疫的作用[42];二是DCs來源的exosomes(Dendritic Cells Derived Exosomes，DEX)。也有研究表明，某些腫瘤細胞和不成熟樹突狀細胞來源的exosomes不能有效增強機體免疫，甚至具有免疫耐受作用。因此，exosomes是否具有抗腫瘤免疫效應，不僅與其來源細胞的特點和功能狀態(tài)有關，也需要對獲得的exosomes進

4、行體內外試驗進行功能驗證。
　　考慮到DC細胞的抗原提呈能力和腫瘤細胞易增殖的特點，有研究者采用雜交瘤技術將DC與骨髓瘤細胞融合制成瘤苗，即克服了DC細胞分離提取和培養(yǎng)困難的問題，也克服了腫瘤細胞免疫原性弱、抗原提呈能力差的弱點，在體內外研究上都顯示出了抗腫瘤效應。但該融合細胞分泌exosomes是否具有融合細胞膜標志的特點、是否具有抗腫瘤作用，報道尚少。本文將骨髓瘤細胞和DC融合，再提取融合細胞分泌的exosomes，進行抗腫瘤

5、效應研究。
　　目的:
　　為獲得理化性質穩(wěn)定、耐高溫、制備時可質控，較細胞性瘤苗更具優(yōu)越性的腫瘤治療疫苗，本文通過收集DC/腫瘤細胞融合細胞上清液，分離提取exosomes，并對其進行鑒定和抗腫瘤效應研究，以期為DC/腫瘤細胞融合疫苗的應用開辟新的途徑。
　　方法:
　　1.DC的提取和培養(yǎng):取6-8周BALB/c雄性小鼠，無菌分離股骨、脛骨和腓骨，髓腔沖洗獲得骨髓細胞，靜置24h，去除未貼壁細胞，將貼壁細胞培

6、養(yǎng)于含10％胎牛血清DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培養(yǎng)液中，加入粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage Colony-Stimulating Factor，GM-CSF)20ng/ml，白細胞介素-4（Interleukin4，IL-4）10ng/ml，誘導其向DC分化。
　　2.骨髓瘤sp2/0細胞培養(yǎng):從液氮中取出細胞株，復蘇后在含10％胎牛血清D

7、MEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，融合前用8-氮鳥嘌呤（8-Azaguanine，8-AG）處理兩周。
　　3.DC與sp2/0細胞融合及鑒定:使用聚乙二醇(Polyethylene Glycol，PEG)化學融合法與電融合法相結合的方法制備DC/sp2/0融合細胞。流式細胞儀分析融合效率，激光共聚焦鑒定融合細胞。
　　4.DC/sp2/0融合細胞的培養(yǎng):融合后將細胞移入96孔板，使用含1％HAT（H-Hypoxanthine次黃嘌呤，A

8、-Aminopterin甲氨喋呤，T-Thymidine胸腺嘧啶核苷）的10％胎牛血清DMEM選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)14天，改用含1％HT（H-Hypoxanthine次黃嘌呤，T-Thymidine胸腺嘧啶核苷）的10％胎牛血清DMEM選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)7天，再改用正常10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)期間加入GM-CSF100ng/ml。
　　5.Exosomes的提取及鑒定:收集經(jīng)篩選后的融合細胞上清，采用密度梯度離心法[15]，提

9、取上清液中exosomes，運用紫外分光光度儀對exosomes進行定量，用投射電鏡觀察exosomes形態(tài)，運用SDS-PAGE和western blot對exosomes進行鑒定。
　　6.T淋巴細胞分離和培養(yǎng):自6-8周BALB/c雄性小鼠脾臟中分離單個核細胞，尼龍毛吸附法獲得T細胞，含IL-2(30μg/ml)的10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。
　　7.T淋巴細胞增殖實驗:在T淋巴細胞培養(yǎng)液中加入exosome

10、s，并用MTT比色法檢測T細胞增殖。
　　8.DCex、imDCex及融合細胞Exosomes對T細胞殺傷腫瘤細胞的影響:將T淋巴細胞培養(yǎng)液中分別加入DCex、imDCex和exosomes，6天后取三組T淋巴細胞作為效應細胞，進行CTL殺傷試驗。設單獨T細胞、骨髓瘤細胞為對照。使用MTT比色法檢測T細胞靶細胞殺傷能力。
　　9.實驗結果用統(tǒng)計學軟件SPSS13.0分析。
　　結果:
　　1.DC與sp2/0細胞

11、融合及鑒定:小鼠骨髓貼壁細胞經(jīng)GM-CSF、IL-4體外誘導培養(yǎng)7d，呈現(xiàn)典型形態(tài)特征的DCs;與骨髓瘤細胞融合效率經(jīng)流式細胞儀檢測為45％左右，激光共聚焦顯微鏡下見到了雙陽性的融合細胞。
　　2.DC/sp2/0融合細胞分泌exosomes的提取和鑒定:融合細胞呈貼壁生長，類圓形，收集上清提取exosomes經(jīng)western blot鑒定顯示，融合細胞分泌的exosomes攜帶有MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ分子。對照組sp2/0細胞分

12、泌的exosomes不帶有MHC-Ⅱ分子。
　　3.T淋巴細胞增殖實驗:融合細胞分泌的exosomes和成熟DCs來源的exosomes有顯著促進T細胞增殖的作用，且與exosomes的劑量呈正相關，與對照組相比P＜0.01。未成熟DC分泌的exosomes不具有促進T細胞增殖的能力，與對照組相比，無顯著差異，P＞0.05。
　　4.CTL實驗:融合細胞分泌的exosomes和成熟DC來源的exosomes能誘導出CTL殺傷