逍遙散抗抑郁有效部位中白術內(nèi)酯類成分藥代動力學研究.pdf

1、選題依據(jù):隨著社會壓力的增大,抑郁癥患病率逐年增多,作為抗抑郁經(jīng)典名方的逍遙散成為了近年來研究的焦點,目前有關逍遙散的研究多集中于藥理活性及作用機制的研究。經(jīng)過多年的基礎研究和臨床實踐均表明其具有良好的抗抑郁作用。逍遙散由8種單味藥組成,成分復雜,本課題組在前期研究中,通過極性分離得到的逍遙散石油醚部位,經(jīng)大量藥理實驗證明抗抑郁活性尤為顯著。然而,目前該復方有效部位應如何合理用藥尚缺乏實驗依據(jù),目前有關其藥代動力學的研究甚少。故而針對該

2、中藥復方有效部位的藥代動力學研究必不可少。本課題組前期根據(jù)譜-效關系的研究,表明其抗抑郁有效組分來自柴胡、當歸、白術。其中白術藥材屬佐藥,具益氣補中、健脾燥濕,基于其成分的復雜性,本課題組又根據(jù)血清藥化的理論,認為能夠入血的成分才有可能為起效成分,通過實驗證明逍遙散中源于單味藥白術的能夠入血的成分主要為白術內(nèi)酯I、II和III。然而,白術內(nèi)酯類成分的體內(nèi)藥動學特點、組織分布及吸收規(guī)律尚不清楚,若明確這些特征,將為劑型選擇及臨床給藥方案的

3、制定提供依據(jù)。為此,本研究以白術內(nèi)酯類成分作為研究對象,進行逍遙散石油醚部位白術內(nèi)酯類成分的藥代動力學研究,以期為逍遙散的合理用藥提供一定依據(jù)。
　　目的:灌胃給予大鼠逍遙散復方與白術單味藥材的石油醚部位,研究白術內(nèi)酯類成分在大鼠血清中的藥動學特性、各組織分布特點以及經(jīng)糞便、尿液的排泄規(guī)律;并采用離體腸翻轉模型,研究逍遙散復方與白術單味藥石油醚部位在大鼠小腸中的吸收動力學并探索配伍對白術內(nèi)酯類成分吸收的影響。為后期藥物新藥研發(fā)、毒

4、理研究及臨床合理用藥提供一定科學依據(jù)。
　　方法:1.建立血清中白術內(nèi)酯I、II和III的HPLC-MS/MS定量測定方法,并用于藥代動力學研究;分別建立大鼠組織、尿液、糞便及離體腸吸收液中白術內(nèi)酯I、II和III的UPLC-PDA定量測定方法,并用于表征此類成分在大鼠組織、尿液、糞便及離體腸吸收液的行為特征。
　　2.選用雄性成年SD大鼠,隨機分為逍遙散組、白術高劑量組、白術中劑量組、白術低劑量組4個組,分別于灌胃前及灌胃

5、后0.17、0.42、0.67、1、1.5、2、4、8、12、24和36h經(jīng)眼眶取血,采用上述建立的HPLC-MS/MS法測定血藥濃度,并比較藥動學行為差異。
　　3.另選用成年SD大鼠,隨機分為2組,即逍遙散給藥組、白術藥材高劑量組,每組25只大鼠,其中20只分別于給藥后15、60、90min和4h分離不同組織,另外5只于給藥后0~2 h,2~4 h,4~6 h,6~8 h,8~12 h,12~24 h,24~36 h,36~4

6、8 h,48~60 h不同時間段收集尿液、糞便樣本。采用UPLC-PDA法分別測定白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ隨時間推移的含量動態(tài)變化規(guī)律,并比較其在配伍前后給藥情況下不同組織的分布特性及排泄規(guī)律差異。
　　4.建立離體腸翻轉模型,SD雄性大鼠于禁食12h后,分離小腸段,制備小腸腸囊并置于逍遙散復方及白術單味藥供試液試管中,于37℃恒溫水浴中孵育后,采用UPLC-PDA法梯度洗脫,于240nm下檢測并指認逍遙散復方及白術單味藥吸收液中的成分

7、,并歸屬共有峰。
　　另外飼養(yǎng)12只雄性SD大鼠,于禁食12h后,分離大鼠小腸不同腸段(十二指腸、空腸、回腸),并將腸段隨機分為逍遙散組、白術高劑量組、白術中劑量組、白術低劑量組4個組,進行離體腸吸收實驗,采用UPLC-PDA法等度洗脫,并于220nm、277nm雙波長檢測不同時間點吸收液中白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ含量,并以白術內(nèi)酯的經(jīng)時累積吸收量對時間作相關回歸分析,獲得其隨時間的動態(tài)變化規(guī)律。其次,比較不同濃度白術供試液中白術內(nèi)酯在

8、大鼠不同腸的吸收,判斷其轉運是否存在濃度依賴性以及特定吸收窗。再次,根據(jù)復方與單味藥的吸收結果,比較配伍對白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ吸收的影響。從而明確該類成分在小腸中的吸收特性。
　　結果:1.建立了血清中白術內(nèi)酯類成分的HPLC-MS/MS定量測定方法,經(jīng)方法學考察,該方法所中白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ能達到的定量限分別為0.117、0.094和0.509ng?mL-1,表明該方法靈敏度較高。根據(jù)精密度、回收率、穩(wěn)定性及基質效應等的考察結果可

9、知,該方法穩(wěn)定、可靠。
　　分別建立了大鼠組織、尿液、糞便及離體腸吸收液的UPLC-PDA測定方法,這幾種樣本的色譜測定條件一致,待測物均能在5min內(nèi)于波長220nm(白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅲ)和277nm(白術內(nèi)酯Ⅱ)條件下較好的分離白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,每種樣本的測定方法經(jīng)方法學考察,結果表明方法靈敏、穩(wěn)定、可靠。
　　2.在藥代動力學實驗中,白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ基于相似的結構,其藥-時曲線呈現(xiàn)一定的相似性。根據(jù)中劑量組藥動參數(shù)可知

10、,白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的Tmax分別為1.08±0.39、0.44±0.07和0.31±0.17,,達峰時間均在1h左右,表明其具有吸收快的特點;從參數(shù)t1/2β可得,白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的t1/2β分別為3.53±2.16、9.72±6.61和4.51±3.99,表明白術內(nèi)酯Ⅰ和Ⅲ的消除較快,而白術內(nèi)酯Ⅱ的消除相對于前兩者較慢。另外,根據(jù)低、中、高劑量組的設置,發(fā)現(xiàn)該三種成分的含量線性增加,呈劑量依賴型。經(jīng)過單位劑量濃度與單位劑量AUC的

11、比較,發(fā)現(xiàn)復方組與白術低劑量組兩組中的白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ無明顯變化,而復方組中白術內(nèi)酯Ⅲ相對于白術低劑量組明顯降低(P<0.05)。方差分析復方組與白術低劑量組的Tmax與Tmax,結果表明復方配伍有減慢白術內(nèi)酯吸收速率,增加白術內(nèi)酯的消除速率的趨勢。
　　3.組織分布與排泄實驗中,復方組的組織及排泄樣本中均未檢測到白術內(nèi)酯。而根據(jù)單味藥白術的組織分布實驗情況來看,白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在肝臟中的分布均較多,除此之外,白術內(nèi)酯Ⅱ在脾、腎中

12、的含量較大,白術內(nèi)酯Ⅲ在肺中的分布量最大,表明此兩種成分與相應的組織間存在著某種特殊的親和力;從分布時間觀察可知,白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ在60min時分布量最大,而白術內(nèi)酯Ⅲ則分布相對較快,15min時含量最高。排泄實驗中,尿液中僅檢測到了白術內(nèi)酯Ⅲ,而在糞便中三種成分均可檢測到,表明白術內(nèi)酯的排泄方式主要通過糞便排出;另外,排泄率的順序為Ⅲ>Ⅰ、Ⅱ,且白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ的排泄率較低,可知白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ可能主要以代謝物的形式排出體外。
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13、.離體腸吸收實驗中,逍遙散復方及白術單味藥的大部分成分均可被小腸吸收,分別發(fā)現(xiàn)了32和25個吸收峰,根據(jù)紫外吸收特征及對照品比對,白術單味藥中的成分主要為白術內(nèi)酯類、多炔類以及其他未知成分;另外,發(fā)現(xiàn)了兩個較為特別的多炔類成分,疑似為腸道菌群的代謝產(chǎn)物。而復方吸收液中的成分主要為多炔類、白術內(nèi)酯類以及來源于當歸的藁本內(nèi)酯成分,經(jīng)比對,復方與白術吸收液的共有峰有三個,經(jīng)指認分別為白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。腸吸收動力學實驗中,以白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ

14、在不同腸段的經(jīng)時累積吸收量對時間進行回歸分析可知,三種成分在不同腸段均為線性吸收,回歸相關系數(shù)大于0.9;經(jīng)不同濃度白術供試液中白術內(nèi)酯在大鼠腸段不同部位的吸收研究,發(fā)現(xiàn)三種成分的吸收對濃度具有依賴性,無特定吸收窗;方差分析逍遙散復方及白術單味藥的經(jīng)時累積量可知,兩組無顯著性差異(P>0.05),表明配伍對白術內(nèi)酯類成分的吸收沒有明顯的影響。
　　結論:本研究建立的分析方法靈敏可行,可成功用于藥代動力學研究,并分別獲得了白術內(nèi)酯Ⅰ