日本血吸蟲(chóng)P7蛋白基因的表達(dá)、鑒定及其免疫診斷價(jià)值的初步研究.pdf

1、目的:為了尋找血吸蟲(chóng)病新的免疫學(xué)診斷候選分子,在大腸桿菌中克隆、表達(dá)日本血吸蟲(chóng)(SjP7)蛋白,建立純化重組抗原間接ELISA方法(rSjP7-ELISA)診斷日本血吸蟲(chóng)病。
　　方法:設(shè)計(jì)引物,用PCR法擴(kuò)增出SjP7樣蛋白基因編碼基因序列,T載體連接,再將其亞克隆入pET28a(+)表達(dá)載體中,經(jīng)酶切、測(cè)序證實(shí)正確后,用IPTG對(duì)該重組菌誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE和Western blot驗(yàn)證表達(dá)量和免疫活性。將純化的rSjP

2、7蛋白和SjAWA包被反應(yīng)板,確定其最適抗原包被量和血清稀釋度,用rSjP7-ELISA和SjAWA-ELISA方法平行檢測(cè)38血吸蟲(chóng)病患者血清;26份鉤蟲(chóng)病患者血清以及40份正常對(duì)照者血清中特異性抗體,比較不同抗原之間敏感性,特異性以及交叉反應(yīng)性。
　　結(jié)果:PCR法擴(kuò)增出一條大小約為423bp大小的SjP7樣蛋白的DNA片斷,將其亞克隆表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+),測(cè)序證實(shí)具有完整的ORF。誘導(dǎo)表達(dá)后,經(jīng)SDS-PAGE可見(jiàn)一條

3、約可見(jiàn)一條約20KDa大小的6-HIS融合蛋白條帶,該融合蛋白均可被經(jīng)預(yù)吸收后陽(yáng)性病人血清所識(shí)別。純化的rSjP7樣蛋白作為抗原做ELISA與SjAWA-ELISA方法平行檢測(cè)血吸蟲(chóng)病患者、鉤蟲(chóng)病患者和正常對(duì)照者血清,結(jié)果顯示:rSjP7-ELISA和SjAWA-ELISA,對(duì)于38份血吸蟲(chóng)病患者血清檢測(cè)的敏感性分別為86.8％和92.1%;26份鉤蟲(chóng)病患者血清抗體的陽(yáng)性率分別為12.5%和25.0%,在40份正常對(duì)照者血清中,rSjP