高糖高脂作用下腎小球系膜細胞蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、隨著生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，糖尿病和高脂血癥的發(fā)病率逐年上升，嚴重威脅人們的健康，其腎損害正日益受到人們的重視。 研究表明，腎臟血流動力學、蛋白質(zhì)非酶糖化、多元醇通路激活、細胞增殖和凋亡等多種因素與：DN的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。另外，脂質(zhì)沉積尚能損傷腎小球系膜細胞移動和收縮功能從而促進糖尿病腎病的進展。 盡管系膜細胞在介導糖尿病和高脂血癥所致腎病中的作用研究進展頗多，但其具體的發(fā)病機理至今仍不十分清楚。系膜細胞的增生、

2、系膜基質(zhì)增多是其共同的病變基礎(chǔ)，但具體牽涉到哪些信號通路、離子通道和哪些蛋白等并不十分清楚，特別是對這些變化因素之間的復雜的、網(wǎng)絡式的關(guān)聯(lián)知之甚少，有必要運用一種高通量、立體式的方法對這些變化因素進行研究。近來的基因組和蛋白質(zhì)組研究技術(shù)就是從整體的角度來研究一種或多種因素對機體影響的較好的方法，因基因型和表現(xiàn)型的不一致性使人們的視線越來越集中到蛋白質(zhì)組的研究。 本實驗采用蛋白質(zhì)組學方法分別研究高血糖、氧化低密度脂蛋白(Ox-LD

3、L)及兩者共同對人腎小球系膜細胞的影響，得出了相應的雙向電泳圖譜，分別找出了差異蛋白質(zhì)點，進一步對差異蛋白質(zhì)進行質(zhì)譜分析，確定了15種蛋白質(zhì)的性質(zhì)，為糖尿病腎病發(fā)病機制的研究提供新的思路。 目的：高糖、Ox-LDL、高糖+Ox-LDL作用下人腎小球系膜細胞蛋白質(zhì)組學研究。 方法： 1．將人腎小球系膜細胞分別置于含正常糖濃度(NC組)、高糖(HG組)、Ox-LDL(OX組)、高糖+Ox-LDL(HO組)及甘露醇高滲

4、對照(OC組)培基中進行體外培養(yǎng)48小時，分別收集細胞，將細胞裂解，收集細胞總蛋白，進行雙向凝膠電泳實驗，第一向采用固相pH等電凝膠電泳，第二向采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，之后進行考馬斯亮藍染色。 2．應用PDQuest雙向電泳圖像分析軟件對2DE圖像進行數(shù)字化分析匹配與對比，并通過統(tǒng)計學處理評價雙向凝膠電泳結(jié)果。 3．在重復實驗中進行實驗方法的優(yōu)化與改良。 4．分組在腎小球系膜細胞2DE圖譜中選取20個

5、明顯表達差異的蛋白質(zhì)點進行膠內(nèi)胰蛋白酶解，再進行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)分析； 5．將質(zhì)譜分析得出的肽質(zhì)量指紋圖經(jīng)過MASCOT數(shù)據(jù)庫檢索分析后，識別鑒定各個蛋白質(zhì)； 6．通過搜索PDB及SWISS-PROT蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，對鑒定出的蛋白質(zhì)進行功能查詢。 結(jié)果： 1、采用優(yōu)化的雙向凝膠電泳技術(shù)取得了重復性較好的2DE圖譜結(jié)果； 2、經(jīng)2-DE分離蛋白質(zhì)，共獲分離膠

6、15塊，每組3塊，通過PDQuest圖象分析軟件對每組三塊膠圖譜分析后顯示：NC組平均蛋白點數(shù) 896±51、匹配點數(shù)733±34、匹配率81.9％；HG組平均蛋白點數(shù)791±86、匹配點數(shù)651±74、匹配率83.5％；OX組平均蛋白點數(shù)698±69、匹配點數(shù)591±54、匹配率84.7％；HO組平均蛋白點數(shù)659±56、匹配點數(shù) 531±42、匹配率80.6％；OC組平均蛋白點數(shù)787±63、匹配點數(shù)657±53、匹配率83.5％。

7、同一組三塊膠的位置重復性顯示：NC組水平偏差1.08mm±0.21mm，垂直偏差1.78mm±0.64mm；HG 組水平偏差1.04mm±0.13mm，垂直偏差2.05mm±0.64mm；OX 組水平偏差1.25mm±0.25mm，垂直偏差1.89mm±0.51mm；HO 組水平偏差 1.32mm±0.21mm，垂直偏差2.21mm±0.76mm；OC 組水平偏差 1.12mm±0.17mm，垂直偏差2.12mm±0.37mm。HG 組

8、與NC組比較共有差異蛋白質(zhì)點42個，其中有24個點僅在NC組表達，18個點在HG組表達上調(diào)；OX組與NC組比較共有差異蛋白質(zhì)點33個，其中有22個點僅在NC組表達，OX組有10個點表達上調(diào)，1個點表達下調(diào)；OC組與NC組比較共有差異蛋白質(zhì)點35個，其中27個點僅在NC組表達，OC組有8個點表達上調(diào)；HO組與NC組比較共有差異蛋白質(zhì)點26個，其中8個點僅在NC組表達，HO組有13個點表達上調(diào)，5個點表達下調(diào)。選取明顯表達差異的20個蛋白質(zhì)

9、點作質(zhì)譜分析，對這些蛋白質(zhì)點進行肽質(zhì)指紋圖分析，鑒定出15種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)涉及細胞骨架、細胞連接、細胞代謝、信號傳導和核酸代謝。 結(jié)論： 1、通過差異蛋白質(zhì)組分析發(fā)現(xiàn)，高糖促進人腎小球系膜細胞的增生及基質(zhì)堆積可能與高糖引起系膜細胞的骨架蛋白、細胞連接蛋白及核酸代謝蛋白的表達改變有關(guān)。Ox-LDL可引起腎小球系膜細胞波形蛋白及屬于連環(huán)蛋白家族的PKP4表達上調(diào)，與核酸代謝相關(guān)的蛋白表達下調(diào)，這可能與高脂誘導系膜細胞凋亡

10、有關(guān)；在高糖和高脂共同作用下，系膜細胞的骨架蛋白、MAPK信號傳導通路蛋白及核酸代謝相關(guān)蛋白的表達均發(fā)生改變，這些變化可能通過影響人系膜細胞的蛋白合成、分化、凋亡及系膜基質(zhì)降解從而加速了糖尿病腎病的進程。糖尿病患者合并高脂血癥會加劇腎臟損害。 2、在15個鑒定出的蛋白質(zhì)中，多肽N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶9 在腎臟組織中的表達得到驗證；另外，屬于β連環(huán)蛋白的PKP4及半橋粒板蛋白以往只在上皮細胞中被發(fā)現(xiàn)，本實驗首次在人腎小球系膜細胞