ABC轉(zhuǎn)運蛋白的抑制增強伊馬替尼對大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞抑制作用的研究.pdf

1、研究背景：
　　 Glioblastoma(GBM)是成年人最常見的腦部腫瘤[1],美國每年將近有16,800新診斷的腦部腫瘤,其中60％是GBM[2][3]；最近的研究表明:患者1年生存率17.7％,2年生存率約為3.3％[4],3年以上的生存率約為1.8％～2.2％[5][6],平均中位生存率大概是8～12個月,盡管如此,在過去的20年里,在GBM治療方法上基本沒有進展[7][8],目前認為,在較徹底的外科手術(shù)切除病灶后,結(jié)

2、合放射治療比單獨只接受外科手術(shù)的療效好,也是目前GBM治療的主要手段[9][10],而只進行放射治療不接受外科手術(shù),治療效果也較差,容易原位復發(fā)[11][12],同時由于GBM的多型性使預后十分不樂觀；因而尋找GBM有效的治療手段,是目前醫(yī)學界的一個難題,而伊馬替尼(Imatinib,STI571,Glivec,Gleevee)的出現(xiàn)為GBM的治療帶來了一線曙光。
　　 Imatinib是一個小分子的靶向酪氨酸激酶抑制劑,它有三

3、個主要的作用靶點,其中PDGFR的酪氨酸激酶是其作用靶點之一[13]。PDGF和PDGFR在膠質(zhì)瘤是過度表達的,并且在膠質(zhì)瘤的信號轉(zhuǎn)導過程中扮演了重要的角色[14]；臨床前研究表明,Imatinib通過抑制僅在膠質(zhì)瘤細胞中才被高度激活PDGF/PDGFR自分泌環(huán),使Rad51的表達降低,增加了膠質(zhì)瘤細胞對放射的敏感性,從而可達到增強治療GBM療效的目的[15][16],綜上所述,這些證據(jù)都預示著Imatinib可能是治療GBM的很有希望

4、的一個藥物,然而臨床試驗結(jié)果卻是令人失望的,Imatinib治療膠質(zhì)瘤的效果微乎其微[17][18]。人們推測因為之一很可能是由于ABC轉(zhuǎn)運蛋白的存在,使到達靶細胞的濃度太低了,無法達到治療效果。膠質(zhì)瘤細胞上ABC轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)的多藥耐藥基因的表達如何?Imatinib是否誘導相關(guān)基因和相關(guān)蛋白的表達?哪種ABC轉(zhuǎn)運蛋白在膠質(zhì)瘤細胞轉(zhuǎn)運Imatinib的過程中起了主要的作用?如何能增強Imatinib對膠質(zhì)瘤的療效?本文圍繞上述問題展開研

5、究。
　　 研究目的：
　　 1.研究Imatinib對C6膠質(zhì)瘤細胞的生長、凋亡、細胞周期的影響；
　　 2.研究Imatinib對C6膠質(zhì)瘤細胞膜上ABC轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)基因和相關(guān)蛋白的表達的影響；
　　 3.觀察Imatinib與主要的ABC轉(zhuǎn)運蛋白之一的P-糖蛋白抑制劑valspodar聯(lián)合給藥后,Imatinib對C6膠質(zhì)瘤細胞的增殖抑制作用的影響以及細胞內(nèi)Imatinib含量的變化,來研究P-糖蛋

6、白在C6膠質(zhì)瘤細胞轉(zhuǎn)運Imatinib過程中的作用。
　　 4.觀察P-糖蛋白表達水平降低后,Imatinib對C6膠質(zhì)瘤細胞的增殖抑制作用的影響,進一步研究P-糖蛋白在C6膠質(zhì)瘤細胞轉(zhuǎn)運Imatinib過程中的作用。
　　 研究方法
　　 1.Imatinib對大鼠C6細胞的增殖抑制作用
　　 (1)研究大鼠C6細胞的生長曲線
　　 常規(guī)培養(yǎng)C6細胞,傳代,分別于24、48、72、96、120、

7、144和168小時,臺盼蘭拒染活細胞計數(shù)法測定細胞生長情況,繪制細胞生長曲線；
　　 (2)研究Imatinib處理前后C6細胞形態(tài)學的變化常規(guī)培養(yǎng)C6細胞,置于倒置顯微鏡下觀察細胞的形狀、大小、生長狀態(tài)等；
　　 (3)研究Imatinib對C6細胞的生長抑制作用常規(guī)培養(yǎng)C6細胞,實驗時將細胞分為9個濃度組,分別為對照組、0.039μM、0.078μM、0.156μM、5μM、10μM、15μM、17.5μM和20μM

8、組,分別于作用24h、48h、72h和96h用MTT法檢測細胞生長抑制率；
　　 (4)研究Imatinib處理C6細胞不同時間的IC50
　　 常規(guī)培養(yǎng)C6細胞,實驗時將細胞分為4個時間組,分別為24h、48h、72h和96h,每個時間組下設(shè)9個濃度組,分別為對照組、0.039μM、0.078μM、0.156μM、5μM、10μM、15μM、17.5μM和20μM組,測定各時間點下的IC50；
　　 (5)研究

9、Imatinib對C6細胞的凋亡誘導作用和對細胞周期的影響
　　 常規(guī)培養(yǎng)C6細胞,實驗時將細胞分為4組,分別為對照組、0.156μM組、10μM組和15μM組,對照組不加藥物。Hoechst 33342/PI染色、Annexin V-FITC/PI雙染法、流式細胞儀檢測細胞凋亡以及細胞周期分布情況。
　　 2.C6細胞ABC轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)基因的表達及改變
　　 常規(guī)培養(yǎng)大鼠C6細胞,實驗時將細胞按Imminib處

10、理濃度分為4組,分別為對照組、低濃度(0.156μM)組、中濃度(10μM)組和高濃度(15μM)組,各濃度組下設(shè)3個時間點,分別為24h、48h和72h；用實時熒光定量PCR法分別檢測C6細胞上mdrla、mdrlb、mrp1、mrp4和bcrp等基因的表達情況,以及Imatinib處理C6細胞后,上述基因表達的變化情況。
　　 3.Imatinib與P-gp抑制劑valspodar聯(lián)合給藥后,對C6細胞的生長抑制作用

11、　　 常規(guī)培養(yǎng)大鼠C6細胞,實驗時將細胞分為對照組、Imatinib組、valspodar組和Imatinib+valspodar組；其中對照組不加任何藥物,Imatinib+valspodar組在加入valspodar30min后加入Imatinib。加藥后作用72h,MTT法檢測各組的細胞生長抑制率。
　　 4.Imatinib與P-gp抑制劑valspodar聯(lián)合給藥前后,C6細胞內(nèi)Imatinib含量的變化
　　

12、 常規(guī)培養(yǎng)大鼠C6細胞,實驗時將細胞分為2組,分別為Imatinib組和Imatinib+valspodax組；其中Imainib組Imatinib的濃度為1μM,Imatinib+valspodar組中Imatinib的終濃度為1μM,valspodar的終濃度為0.5μM；每組的細胞各培養(yǎng)3瓶,用LC-MS-MS法測定Imatinib聯(lián)合valspodar前后,細胞內(nèi)Imatinib的含量。
　　 5.Mdrlb基因干擾后

13、,Imatinib對C6細胞的增殖抑制作用
　　 常規(guī)培養(yǎng)大鼠C6細胞,實驗時將細胞按Imatinib濃度分為8組,分別為對照組、0.156μM、10μM、15μM、干擾對照組、干擾后0.156μM、干擾后10μM和干擾后15μM組,其中對照組不加任何藥物,干擾對照組只加lipo2000脂質(zhì)體和非特異性siRNA。RT-qpcr和western blot分別檢測RNA干擾后,mdr1b基因和P-糖蛋白的表達水平；MTT法檢測各組

14、細胞的生長抑制率。
　　 6.統(tǒng)計學方法
　　 實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差((x)±s)表示,應(yīng)用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理。若只有一種影響因素則采用單因素方差分析(one-way ANOVA)；兩種因素以上采用析因分析,有交互效應(yīng)時進行單因素效應(yīng)分析,無交互效應(yīng)時,每種因素可采用單因素方差分析；多重比較若方差齊采用LSD法,方差不齊時采用近似F檢驗(Welch方法)及多重比較的Dunnett's T3方法；兩組間均

15、數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗分析；P<0.05(雙側(cè))表示差異有顯著性。
　　 結(jié)論：
　　 1.本實驗首次報道Imatinib可抑制C6膠質(zhì)瘤細胞的生長,且具有時間-濃度依賴性但IC50較高；
　　 2.Imatinib抑制C6膠質(zhì)瘤細胞的生長的機制是誘導細胞凋亡的發(fā)生,細胞凋亡率呈時間-濃度依賴性；同時Imatinib可使C6細胞在G0/G1期出現(xiàn)阻滯。
　　 3.本實驗首次發(fā)現(xiàn)Imatinib可誘導AB

16、C轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)基因和相關(guān)蛋白的表達,介導了Imatinib對C6細胞的增殖抑制作用；
　　 4.P-gp抑制劑Valspodar與Imatinib聯(lián)合給藥后,明顯增強Imatinib對C6細胞的增殖抑制作用,表明P-gp可介導C6細胞對Imatinib的不敏感性；
　　 5.RNA干擾使P-gp蛋白表達水平下調(diào)后,明顯增強Imatinib對C6細胞的增殖抑制作用,進一步表明P-gp可介導C6細胞對Imatinib的不敏感