MHV-3誘導的小鼠SARS模型及其在SARS感染中的研究應用.pdf

1、[目的] 1.克服現(xiàn)有嚴重急性呼吸綜合征(SARS)動物模型的局限性，提供一種建立SARS冠狀病毒小鼠模型的方法，為系統(tǒng)研究SARS疾病的病原學與發(fā)病機制提供技術(shù)平臺。 2.結(jié)合小鼠SARS模型肺臟中鼠纖維介素基因(mfgl2凝血酶原酶基因)的特異性表達來探討SARS肺損傷的可能機制及其臨床意義。 3.結(jié)合小鼠SARS模型肝組織的病理學變化、病毒分布及肝功能損傷情況，探討SARS合并肝臟損傷的可能機制。

2、[材料與方法] 實驗組Balb/cJ近交系小鼠通過呼吸道途徑感染100PFU鼠肝炎3型病毒(MHV-3)，平行設(shè)立生理鹽水對照組，觀察兩組小鼠的一般情況并繪制生存曲線。在獲得穩(wěn)定生存曲線的前提下，另外制備動物模型，分不同時間點(1d、2d、3d、4d)收集血清標本和組織臟器標本，后者包括肺臟、脾臟、肝臟、腎臟、小腸、心臟和腦組織，觀察大體情況后根據(jù)檢測目的，部分組織速凍于液氮，部分組織固定于10％福爾馬林，常規(guī)制備石蠟切片。蘇木

3、素/伊紅(H&E)染色觀察各器官的組織病理學改變。標準噬斑法動態(tài)觀察各組織器官病毒滴度的變化情況。針對MHV-3N基因區(qū)保守序列設(shè)計兩段寡核苷酸探針，原位雜交方法檢測病毒侵犯組織器官的細胞類型。運用mfgl2多克隆抗體和特異性探針檢測mfgl2凝血酶原酶在肺臟中的表達情況。免疫組化雙染色觀察肺臟中mfgl2凝血酶原酶表達與纖維素沉積間的關(guān)系。每個時間點三只小鼠血清標本送檢本院檢驗科測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、白蛋白(

4、ALB)、總膽紅素(TBiL)的水平。 [結(jié)果] 1.MHV-3呼吸道途徑誘導的小鼠SARS模型的建立 實驗組小鼠通過氣管途徑感染100PFUMHV-3后5天內(nèi)死亡率高達100％，生理鹽水對照組小鼠全部存活且健康生長。組織病理學觀察發(fā)現(xiàn)病變可累及多個臟器。肺臟呈現(xiàn)典型間質(zhì)性肺炎樣改變伴廣泛透明膜、微小血栓形成；脾臟白髓萎縮，淋巴細胞稀疏，晚期脾小體偶見局灶性壞死，結(jié)構(gòu)不清；輕度到中度非特異性炎性改變亦見于肝臟、腎

5、臟等其他器官。所有收集的臟器均可檢測到病毒的分布，隨著感染時間的延長，病毒在各組織臟器中的繁殖呈現(xiàn)上升趨勢，采用單因素方差分析觀察感染后2d各組織臟器的病毒滴度差異，認為該時間點病毒滴度的分布具有組織器官差異性，其中肺臟、脾臟、肝臟病毒滴度顯著高于腎臟、小腸、心臟和腦組織。原位雜交技術(shù)檢測到病毒侵犯的細胞類型包括：支氣管漿液腺上皮細胞、肺內(nèi)間質(zhì)浸潤細胞、肺泡上皮細胞、脾臟生發(fā)中心周圍淋巴細胞、肝實質(zhì)細胞、遠曲腎小管上皮細胞、小腸黏膜上皮

6、細胞、心肌細胞和大腦神經(jīng)元。 2.mfgl2凝血酶原酶在小鼠SARS模型肺臟中的表達 運用兔源性mfgl2多克隆抗體和特異性的探針可以在感染后肺組織支氣管漿液腺上皮細胞、間質(zhì)浸潤細胞和肺泡上皮細胞中檢測到mfgl2蛋白和mfgl2mRNA的特異性高表達。免疫組化雙染色發(fā)現(xiàn)肺內(nèi)微小血栓及透明膜形成的區(qū)域多見mfgl2凝血酶原酶與纖維素的共沉積。 3.MHV-3誘導的小鼠SARS模型的肝損傷研究 組織病理學發(fā)

7、現(xiàn)肝臟小葉結(jié)構(gòu)基本完整，肝細胞彌漫混濁腫脹，大面積氣球樣變和水樣變，匯管區(qū)少量淋巴細胞浸潤，偶見中央靜脈周圍肝細胞的點灶狀壞死。隨著感染時間的延長，肝內(nèi)病毒復制加劇，病毒可直接侵犯肝臟實質(zhì)細胞，出現(xiàn)以ALT和AST升高為主的肝功能損傷。 [結(jié)論] 1.MHV-3呼吸道途徑誘導的小鼠SARS模型重復性好、臨床癥狀明顯，可以復制出與人類SARS相似的疾病特征，將為系統(tǒng)的研究SARS疾病的病原學、發(fā)病機制及疫苗研制、有效藥物的

8、篩選提供一種較為理想的技術(shù)平臺。 2.mfgl2凝血酶原酶在模型肺臟的特異性高表達可激活凝血酶原，啟動局部凝血過程，導致纖維素沉積，促進肺內(nèi)血栓和透明膜的形成，最終導致通氣血流障礙和血氧飽和度下降而造成肺臟功能的衰竭。提示除了病毒本身所致細胞病變，mfgl2凝血酶原酶可能成為SARS病程中肺功能損傷的又一重要分子機制。 3.與人類SARS肝損傷相似，MHV-3呼吸道途徑誘導的小鼠SARS模型其肝臟實質(zhì)性病變較輕，可能僅為