proBDNF影響新生大鼠SGNs存活及神經突生長的實驗研究.pdf

1、目的:建立穩(wěn)定可靠的無血清SGNs體外培養(yǎng)體系，使用免疫熒光染色對SGNs進行鑒定，觀察培養(yǎng)的SGNs存活數(shù)目及神經突生長規(guī)律。比較不同濃度proBDNF對培養(yǎng)SGNs存活及的影響，并與BDNF組比較。觀察SGNs中p75NTR的表達特點，驗證JNK信號通路在proBDNF影響SGNs存活中的作用。
　　方法:取新生3-5天SD大鼠處死并解剖出含有螺旋神經節(jié)的蝸軸，將蝸軸剪成小塊后直接接種于層粘連蛋白及右旋多聚賴氨酸包被好的8孔腔

2、式載玻片中，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h獲得貼壁牢固的SG組織塊;或將蝸軸于胰蛋白酶中消化30分鐘，胎牛血清終止消化后吹打成細胞懸液。漂洗、重懸后將細胞懸液接種子包被的8孔腔式載玻片中，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h獲得貼壁牢固的原代SGNs。選擇消化法培養(yǎng)SGNs，隨機分為對照組、BDNF組(BDNF，10ng/ml)、C10組(proBDNF,10ng/ml)、C50組(proBDNF,50ng/ml)、C100組(proBDNF,10

3、0ng/ml)，分別在培養(yǎng)液中加入各濃度的營養(yǎng)因子。繼續(xù)培養(yǎng)48h后所有SGNs行TUJ l、p75NTR及DAP1免疫熒光染色，熒光顯微鏡下觀察SGNs的存活數(shù)目和神經突再生情況，并進行相關統(tǒng)計分析。另培養(yǎng)一批SGNs，培養(yǎng)4h后隨機分為三組，分別添加50ng/ml proBDNF、50ng/ml proBDNF+20μMSP600125、20μMSP600125，其余步驟同上進行。
　　結果:組織塊法培養(yǎng)的螺旋神經節(jié)組織貼壁牢

4、固，大量神經突從組織塊向外伸展，周圍區(qū)域零散分布著存活良好的SGNs。消化法培養(yǎng)的單離SGNs生長狀態(tài)較均一，培養(yǎng)52h后可見無突起、單極突起、雙極突起、多極突起等形態(tài)類型的SGNs，其中單極突起SGNs數(shù)目最多，為48.2±4.2/孔，無突起和雙極突起SGNs數(shù)目分別為20.0±4.9/孔、7.5±2.2/孔，多極突起SGNs數(shù)目最少，為4.2±1.9/孔。添加不同濃度proBDNF作用48h后，對照組的SGNs存活數(shù)目為79.8±5

5、.3/孔，BDNF組存活數(shù)目為82.3±6.0/孔，C10組、C50組、C100組分別為69.7±6.3/孔、54.3±4.6/孔、22.7±4.1/孔。c50組和c100組的SGNs存活數(shù)目低于對照組(P＜0.001)，且C10組、C50組和C100組的SGNs存活數(shù)目均低于BDNF組(P＜0.001)。將SGNs的形態(tài)分為無突起和有突起兩類，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)C10組、C50組、C100組的無突起SGNs比例均高于對照組(P＜0.001)。另

6、外在添加20μM的SP600125后，C50組的SGNs存活數(shù)目提升至91.5±8.2/孔，高于沒有使用SP600125的C50組(P＜0.001)。
　　結論:組織塊培養(yǎng)法和無血清消化培養(yǎng)法都能成功培養(yǎng)出SGNs。使用消化培養(yǎng)法更容易獲得生長狀態(tài)均一的單離SGNs，消化培養(yǎng)法比組織塊培養(yǎng)法更適合用于體外因素影響SGNs存活與生長的研究。proBDNF可以促進體外培養(yǎng)SGNs的凋亡，并抑制神經突的再生。proBDNF會導致SGNs