聚乙二醇化干擾素α-2a與干擾素α-2a在體內(nèi)和體外的抗乙型肝炎病毒活性研究.pdf

1、乙型肝炎病毒屬嗜肝DNA病毒科，具有嚴格的種屬和組織特異性，它只傳染人和類人猿等靈長類動物，或者是這些動物的原代培養(yǎng)肝細胞。病毒與靶細胞受體結(jié)合進入體內(nèi)，在肝細胞特異性細胞因子作用啟動病毒復制。 1．重組腺病毒的生物學特征的鑒定利用所構(gòu)建的具復制能力的HBV重組腺病毒傳染體外培養(yǎng)肝細胞，觀察HBV的表達情況，從而初步了解該重組HBV腺病毒的生物學特性。 重組腺病毒傳染細胞后，連續(xù)七天在細胞內(nèi)均可檢測到腺病毒載體，證明了重

2、組腺病毒對細胞的易感性和高效的基因轉(zhuǎn)移能力。重組腺病毒傳染細胞后第三天可以在培養(yǎng)上清中檢測到腺病毒基因，隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)上清中腺病毒含量增加?？赡苁请S著培養(yǎng)時間的延長，細胞增殖到一定程度后開始老化、死亡、脫落，從而使部分重組腺病毒釋放進培養(yǎng)上清中。 2．重組腺病毒傳染L02細胞后HBV復制的動態(tài)分析將重組腺病毒介導的具自行復制能力的HBV傳染人正常肝細胞株L02，獲得能表達HBV標志物的細胞模型，應用酶聯(lián)免疫技術(shù)動態(tài)觀察

3、L02細胞內(nèi)HBsAg和HBeAg的表達；HBV熒光定量PCR檢測培養(yǎng)上清中HBV DNA載量； 以不含蛋白酶的裂解液裂解細胞，利用cccDNA和rcDNA與蛋白質(zhì)結(jié)合能力的差異提取cccDNA，并以綠豆核酸酶消化殘留的rcDNA；利用cccDNA和rcDNA結(jié)構(gòu)上的差異，設(shè)計跨越負鏈缺口的引物，并通過熒光定量PCR檢測cccDNA，探討重組腺病毒傳染L02細胞后細胞內(nèi)cccDNA的變化。 以病毒含量分別為10<'7>、

4、10<'6>拷貝/ml的乙型肝炎患者血清進行引物的特異性檢測，結(jié)果均為陰性，證明引物對HBV cccDNA具有特異性。 質(zhì)粒標準品倍比稀釋為10<'2>，10<'3>，10<'4>，10<'5>，10<'6>，10<'7>拷貝/ml進行引物的敏感性檢測，質(zhì)粒在10<'3>-10<'7>范圍內(nèi)均能檢測到信號，因此，該方法的敏感性可以達到10<'3>拷貝/ml。 以該特異性引物進行熒光定量PCR檢測重組腺病毒傳染后L02細胞

5、后細胞內(nèi)cccDNA的量，cccDNA在傳染后一天即可在細胞內(nèi)檢測到，第四天達到高峰，隨后呈下降趨勢，但仍維持相對穩(wěn)定狀態(tài)。認為cccDNA的穩(wěn)定維持在一定水平，既能滿足病毒復制的需要，又不會對細胞產(chǎn)生毒性，有利于維持病毒對細胞的長期傳染狀態(tài)。 HBV熒光定量PCR檢測培養(yǎng)上清中HBV DNA，培養(yǎng)上清中HBV DNA含量在病毒傳染細胞后第五天達到最高，隨后維持穩(wěn)定狀態(tài)。 ELISA檢測培養(yǎng)上清中HBsAg和HBeAg的

6、分泌，HBsAg和HBeAg的表達量隨培養(yǎng)時間的延長而增加，第六天達到高峰，隨后呈下降趨勢。一是由于細胞生長已到達平臺期，細胞內(nèi)已建立一種穩(wěn)定的病毒傳染狀態(tài)；二是隨著時間的延長，培養(yǎng)的細胞幾乎停止分裂生長，細胞合成代謝功能降低，出現(xiàn)老化現(xiàn)象，因此完全依賴于細胞功能才能進行復制和表達的病毒，其復制水平也會隨之下降。對。HBV cccDNA、HBV DNA、HBsAg和HBeAg進行Spearman相關(guān)性分析，培養(yǎng)上清中HBV DNA的量與

7、HBsAg和HBeAg的分泌量之間存在正相關(guān)關(guān)系，分別為：r<,s>=0.881，P=0.004(雙側(cè))；r<,s>=0.857,P=0.007(雙側(cè))，從而認為HBV蛋白表達規(guī)律與培養(yǎng)上清中HBV DNA相關(guān)，而細胞內(nèi)HBV cccDNA與培養(yǎng)上清中HBV DNA的量及HBsAg和HBeAg的分泌量之間無明顯相關(guān)性(P>0.05)。 3．IFNa-2a與Peg-IFNa-2a在體外對HBV復制的影響以重組腺病毒傳染的L02細胞

8、為細胞模型，通過觀察IFNa-2a與Peg-IFNa-2a處理前后培養(yǎng)上清HBV DNA、細胞內(nèi)HBV cccDNA、HBsAg與HBeAg的變化，比較。IFNa-2a與Peg-IFNa-2a的體外抗病毒作用，并觀察該兩種干擾素對乙型肝炎病毒復制的第一個環(huán)節(jié)有無抑制作用。 以MTT法進行細胞毒性檢測，在本實驗濃度下，IFNa-2a與Peg-IFNa-2a對腺病毒傳染的L02細胞均無細胞毒性作用(P>0.05)。 結(jié)果顯示

9、，Peg-IFNa-2a藥物組中，三個藥物濃度組處理的細胞中HBsAg及HBeAg與對照組比較，均無顯著性差異(P>0.05)。IFNa-2a藥物組中，劑量為100 IU/ml組的細胞分泌的HBsAg及HBeAg與對照組比較，無顯著性差異(P>0.05)；劑量為500 IU/ml組及1000 IU/ml組的細胞分泌的HBsAg及HBeAg與對照組相比顯著減少(P<0.05，P<0.001)，認為IFNa-2a在劑量為500 IU/ml以

10、上時對重組腺病毒傳染的L02細胞的HBV抗原分泌有抑制作用。 HBV熒光定量PCR檢測培養(yǎng)上清中HBV DNA及應用HBV cccDNA特異性引物進行熒光定量PCR檢測細胞內(nèi)cccDNA含量。Peg-IFNa-2a藥物組中，三個藥物濃度組處理的細胞培養(yǎng)上清中HBV DNA含量與對照組比較，均無顯著性差異(P>0.05)。IFNa-2a藥物組中，劑量為100 IU/ml組的細胞培養(yǎng)上清中HBV DNA含量與對照組比較，無顯著性差異

11、(p>0.05)；劑量為500 IU/ml組及1000 IU/ml組的細胞培養(yǎng)上清中HBV DNA含量與對照組相比顯著減少(P<0.05)，認為IFNa-2a在劑量為500 IU/ml以上時對重組腺病毒傳染的L02細胞內(nèi)HBV DNA的合成有抑制作用。比較各組細胞內(nèi)HBV cccDNA，各藥物組細胞與對照組細胞的cccDNA含量均無顯著性差異(p>0.05)，認為短期的藥物處理不能抑制細胞內(nèi)cccDNA的合成。 4．IFNa-2

12、a與Peg-IFNa-2a在體內(nèi)對HBV復制的影響利用重組腺病毒傳染小鼠，使HBV基因在小鼠體內(nèi)表達，構(gòu)建HBV傳染的小鼠模型，利用該模型研究IFNa-2a和Peg-IFNa-2a的體內(nèi)抗病毒作用，并觀察IFNa-2a與Peg-IFNa-2a對小鼠體內(nèi)HBV cccDNA的清除是否存在差異。 重組腺病毒以尾靜脈注射的方法接種4周齡的昆明小鼠，接種劑量為2×10<'9>pfu，建立HBV傳染的動物模型。分別以IFNa-2a與Peg

13、-IFNa-2a對小鼠進行皮下注射，參照人體臨床用藥，IFN α-2a用藥劑量為1.7×10<'3>IU/只，三次/周；Peg-IFNa-2a用藥劑量為0.06μg/只，一次/周；以生理鹽水為對照組，一次/周。分別于第4周和第8周觀察腺病毒介導的HBV在小鼠體內(nèi)的復制情況及藥物對HBV在體內(nèi)復制的影響。提取兩個藥物組和對照組傳染小鼠血清DNA及肝臟DNA，以HBV特異性引物進行PCR檢測，傳染小鼠血清及肝臟中結(jié)果均為陽性。 以腺

14、病毒特異引物進行PCR反應，檢測傳染小鼠血清及肝臟中的腺病毒基因組。第4周時三組傳染小鼠肝臟中均可檢出腺病毒DNA，第8周時再次檢測傳染小鼠肝臟中腺病毒DNA，結(jié)果均為陰性；而三組傳染小鼠血清中一直不能檢測出腺病毒DNA。結(jié)果表明，小鼠血清中不含重組腺病毒，血清中的HBVDNA是由于病毒在體內(nèi)復制而產(chǎn)生的子代病毒。 采用ELISA法檢測了小鼠血清中IFN-丫含量，各實驗組間IFN-丫含量比較有顯著性差異(P<0.001)，但不同

15、時間(第4周和第8周)各組IFN-丫含量比較無顯著性差異(P>0.05)。各實驗組進行兩兩比較，結(jié)果表明，Peg-IFNa-2a組和IFNa-2a組與對照組比較均有顯著性差異(P<0.05)；比較兩個藥物組之間所誘生的IFN-丫的含量，Peg-IFNa-2a組高于IFNa-2a組(P<0.05)。認為Peg-IFNa-2a與IFNa-2a在體內(nèi)均具有免疫調(diào)節(jié)能力，但Peg-IFNa-2a的免疫調(diào)節(jié)作用強于IFNa-2a。 熒光定

16、量PCR檢測小鼠血清HBV DNA，比較各實驗組小鼠血清中的病毒含量變化，結(jié)果顯示，兩個藥物組與對照組比較均有顯著性差異(P<0.05)，表明兩個藥物對小鼠血清中病毒均有抑制作用。兩個藥物組之間比較無顯著性差異(P>0.05)；各實驗組中血清病毒載量在第4周與第8周的差異無顯著性(P>0.05)，從而認為Peg-IFNa-2a與IFNa-2a在本實驗時間范圍內(nèi)對小鼠血清中病毒的作用無差異。傳染小鼠肝臟DNA以綠豆核酸酶處理，以HBV c

17、ccDNA特異性引物進行熒光定量PCR檢測傳染小鼠肝臟中HBV cccDNA含量。結(jié)果顯示，第4周與第8周時三組傳染小鼠肝臟中HBV cccDNA含量均無顯著性差異(P>0.05)。從而認為IFNa-2a與Peg-IFNa-2a雖然能抑制血清中的病毒復制，但對肝臟內(nèi)HBVcccDNA的影響不顯著。 結(jié)論：建立復制型HBV重組腺病毒的體外傳染和體內(nèi)傳染模型。重組腺病毒在體外培養(yǎng)細胞中可以表達HBV、HBsAg和HBeAg，并可檢測