津田蕪菁花青素合成非依光型T-DNA突變體的構建及分析.pdf

1、基因組學研究的一個重要手段是構建大規(guī)模突變體庫，通過分析突變體的表型從而鑒定突變基因的功能是功能基因組學研究最直接有效的方法。T-DNA是目前使用最廣泛的插入元件，已在許多植物中利用其進行突變體庫的構建和篩選，從而研究基因的功能。本研究組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，UV-A特異誘導津田蕪菁膨大肉質根表皮的花青素合成，推測在植物中可能存在不同于UV-A/藍光受體的UV-A特異的受體。津田蕪菁花青素合成非依光型T-DNA插入突變體的構建將為研究UV

2、-A特異誘導花青素合成途徑中相關基因及信號轉導因子建立平臺。
　　本研究制作了津田蕪菁花青素合成非依光型T-DNA突變群體并對突變群體進行了初步鑒定分析。得到了以下結果:
　　成功從pBI121質粒中克隆了GUS基因，測序分析顯示GUS基因序列全長1812bp，Blast序列比對顯示序列正確。采用Gateway技術，成功構建了表達載體pH7WG2D，1-GUS,該植物表達載體含GFP選擇性標記基因、GUS選擇性標記基因、潮霉

3、素植物選擇標記以及CaMV35s啟動子。
　　以津田蕪菁花序軸為外植體進行農桿菌介導的組培遺傳轉化探索，并根據蕪菁難于再分化的特性設置了35種不同6-BA和NAA組合的分化培養(yǎng)基，結果表明此種方法不能使蕪菁分化出再生芽。采用農桿菌真空滲透萌發(fā)種子的方法進行蕪菁非組培遺傳轉化的探索，并設置了干種子未超聲、干種子超聲、浸泡種子未超聲、浸泡種子超聲四種實驗條件。綠色熒光蛋白篩選及GUS組織化學染色初步鑒定表明浸泡種子超聲的轉化率最高，陽

4、性結果達到60％。
　　對T-DNA插入突變體庫進行篩選，獲得花青素合成不受光誘導的全紅突變體以及花青素不合成的全白突變體。通過篩選約10000株T1代津田蕪菁，獲得200株系目標突變體。種植篩選出的T2代突變體，共獲得17個全紅株系，60個全白株系。對轉基因植株進行了gfp、gus、hyg和35s prmoter四個標記基因的PCR鑒定。其中全紅表型突變體3、4號，全白表型突變體7、9號四個標記基因PCR結果均有條帶。經TAIL