生長抑素作為全身炎癥反應放大的內源性保護因素研究——從中性粒細胞到補體激活.pdf

1、背景和目的 多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)是創(chuàng)傷及感染后最嚴重的并發(fā)癥，對其進行臨床研究具有重要的意義。PMN凋亡異常引起功能及數量上的改變，是MODS發(fā)生發(fā)展的重要機制之一。中性粒細胞作為炎癥反應的重要細胞，一方面對機體的防御起著重要作用，另一方面在炎癥部位長期存活則可加重組織損傷。補體系統(complement system)是機體抵御病原體入侵的主要

2、效應系統，是天然免疫系統的一個重要組成部分。補體在MODS的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用。缺血再灌注腸道促炎介質放大炎癥反應，引起MODS，腸道麻痹、梗阻、功能障礙使腸道成為病原庫和毒素庫，導致MODS，后期繼發(fā)感染進一步加重腸功能障礙，因此腸道是MODs的啟動器官和靶器官。生長抑素(somatostatin，SST)對免疫系統的影響已逐漸被認識。探討多器官功能障礙綜合征的規(guī)律，以增加對全身炎癥反應內源性保護機制的認識，為臨床治療各種

3、原因導致的MODS提供新思路。 方法 給健康獼猴獼猴皮下注射麻醉劑麻醉動物，常規(guī)外科消毒鋪巾，取腹正中切口，逐層分離入腹腔后，分離腸系膜上動脈后予以夾閉，60 min后松夾進行再灌注，恢復腸系膜上動脈血流。在距回盲部5cm處切除回腸2cm，用以測定組織中SST。IIR前后外周靜脈采血lOml，用于測定SST。用放射免疫分析法測定外周血、腸黏膜生長抑素濃度。采集健康獼猴HR前和IIR后2、6、24 h外周靜脈血，肝素抗凝

4、。Pcrcoll不連續(xù)密度梯度離心法分離純化PMN。腹腔巨噬細胞分離收集，健康獼猴，于RR前、IIR后24 h，灌洗腹腔，回收灌洗液。在獼猴IIR后，觀察血中性粒細胞、腹腔巨噬細胞凋亡情況。SST與獼猴外周血PMN、腹腔巨噬細胞體外共同孵育后，觀察PMN、腹腔巨噬細胞的形態(tài)變化，采用顯微鏡、熒光顯微鏡觀察獼猴外周血中性粒細胞、腹腔巨噬細胞的形態(tài)變化。流式細胞儀測定細胞凋亡率。DNA抽提及DNA電泳，紫外光透射儀下觀察電泳條帶并拍照，電泳

5、分析細胞DNA斷裂片段，觀察DNA電泳凋亡帶(DNA Ladder)。透射電鏡下觀察獼猴外周血中性粒細胞、腹腔巨噬細胞的形態(tài)變化并攝片。免疫細胞化學法檢測Bcl-2、IL-1、NF-κB。用生物分子相互作用系統(Biacore)檢測PMN上生長抑素受體(SSTR-1、SSTR-2)。免疫速率散射比濁法進行檢測補體、CRP，采用IMMGE免疫速率散射比濁儀(Beckman Coulter，加利福尼亞，美國)及配套試劑進行檢測。CHso法測

6、定總補體，將新鮮待檢血清做不同稀釋后，與致敏的綿羊紅細胞反應，以50％溶血時的最小血清量判定終點，測定補體總溶血活性。用生長抑素與獼猴血清作用，測定補體、CRP。肝細胞的分離和培養(yǎng)，用生長抑素與分離的肝細胞培養(yǎng)，測定補體、CRP。采用聚乙二醇(PGE艦淀法測定循環(huán)免疫復合物(CIC)，應用IMMGE(Beckman Coulter，加利福尼亞，美國)中的紫外分光檢測部分進行檢測。腸缺血再灌注后24h，手術取出動物的小腸、心、肝、腎、肺、

7、腦等器官進行組織學觀察。 結果 1.獼猴重要器官的改變，IIR后24h，所有獼猴均出現了MODS，腸、肺、肝、腎等重要器官組織學觀察，均發(fā)現有明顯的炎性損傷。2.獼猴ⅡR后，獼猴外周血及小腸黏膜中SST含量均明顯下降；小腸黏膜SST含量在ⅡR前、后分別為256.4l±7.98ng/mg組織和179.83±44.5ng/mg組織，外周血SST含量則分別為160.6l±33.84ng/mg和62.7±13.56png/mg

8、，p<0.01。3.PMN凋亡率由ⅡR前的15.4±1.4[％]，顯著降低至ⅡR后24 h 3.5±0.5[％]；4.腹腔巨噬細胞凋亡率由腸缺血再灌注前14.1±1.6[％]增加至腸缺血再灌注后24 h 20.2±1.8[％]；5 .外實驗表明，SKT 可使獼猴外周血中性粒細胞在形態(tài)學上表現特征性改變，顯微鏡觀察見中性粒細胞體積變小，胞漿濃縮，胞核固縮，染色質凝集邊聚，核碎裂。丫啶橙、溴化乙錠混合熒光染色，凋亡細胞表現為細胞體積縮小，胞

9、漿濃縮，核內染色質固縮成團，染色質凝集，細胞呈桔紅色，對照組細胞細胞體積較大，核膜、胞膜完整，呈綠色，核結構正常。6.PMN超微結構變化：透射電鏡觀察到，SST作用后的細胞質、細胞核電子密度加大，細胞體積縮小，細胞膜皺縮出現皺摺、卷曲，形成膜表面的芽狀突起。細胞質濃縮，細胞質和細胞器密度增高，細胞器密集壓縮，核染色質固縮致密，聚集于核膜下成塊狀，為染色質邊聚，細胞核固縮變小。未經SST作用對照組PMN體積較大，核膜、胞膜完整，細胞質染色

10、淡，細胞器排列疏松，細胞核較大。7.PMN的DNA片段斷裂分析電泳可見Ladder帶。8.體外SST對PMN凋亡的影響，PMN凋亡率明顯高于對照組；生長抑素能抑制巨噬細胞凋亡，巨噬細胞凋亡比例降低。9.PMN上SSTR能與SSTR-1抗體、SSTR-2抗體發(fā)生結合反應，其特異結合量分別為548±20RU/ml及28±21RU/ml。10.MODS時血清補體C<,3>活性降低，血清補體C<,3> ⅡR前為0.9992±0.14g／1，II

11、R后24h為0.7024±0.18 g／l；MODS時血清總補體活性降低，總補體IIR前為106.6±18.07U／ml，IIR后為62.1±9.52U／m。11.MODS時血清補體C<,4>活性沒有改變，血清補體C<,4>IIR前為O.1342±0.07g／l，IIR后24h為O.1420±0.06 g／l。12.MODS時血清CRP升高，IIR前為4.33±1.31mg／lIIR后為17.73±0．86 mg／l；MODS時血清循環(huán)

12、免疫復合物測定，IIR后血清循環(huán)免疫復合物無明顯變化，IIR前為0.013±0.005 O.D，IIR后為0.030±0.01 O.D，無統計學意義。13.生長抑素對血清補體影響，在IIR前、IIR后2、6、24h各時段，IIR+SST組與IIR組比較，血清補體C<,3>阻斷后24 h IIR+SST組為0.7084±0.19g／1，IIR組為0.7024±O.18g／1；血清補體C<,4>阻斷后24 h IIR+SST組為O.1293

13、±0.04g／1，IIR組為O.1420±0.06g／1；血清總補體阻斷后24總補體SST組與IIR組比較，無統計學意義。不同濃度生長抑素對血清補體沒有明顯作用，隨著生長抑素濃度增加，血清補體沒有明顯改變，與生長抑素及其濃度無關。14.生長抑素對獼猴血清CRP、循環(huán)免疫復合物影響，在IIR前、IIR后24h各時段，IIR+SST組與IIR組與比較。血清CRP IIR后24h IIR+SST組為20.83±4.98g/l，IIR組為17.

14、73±0.86g/l；血清循環(huán)免疫復合物IIR后24 h IIR+SST組為0.0233±0.005 O.D，IIR組為0.0300±0.01 O.D，血清CRP、循環(huán)免疫復合物SST組與IIR組與比較無統計學意義。15.IL-1、NF-кB在IIR后，IL-1、NF-кB表達明顯增加，陽性細胞呈棕黃色，染色深。16.用Bcl-2免疫細胞化學染色觀察到，腸缺血再灌注后，PMN內褐黃色。 結論 l.SST通過PMN上的相

15、應受體誘導PMN凋亡，維持恰當的炎癥反應；腸缺血-再灌注降低了小腸黏膜或外周血SST水平，使這一內源性的生理保護機制受到破壞，其結果是，體內促進PMN凋亡的因素減少，PMN的壽命延長、壞死增加，由此加重腸黏膜等器官的組織損傷，炎癥失控，引起MODS。2.從多方面的形態(tài)學觀察、凋亡細胞定量及具有特征性的DNALadder凋亡帶的結果表明，SST能誘導PMN凋亡。3.巨噬細胞在體外與SST孵育后，不論是來自形態(tài)學還是流式細胞儀的檢測都表明，

16、SST可抑制巨噬細胞凋亡，這將有利于巨噬細胞吞噬凋亡PMN。如果凋亡的PMN細胞數量過多或凋亡的PMN由于種種原因不能及時被清除，單核細胞來源的巨噬細胞成熟度不夠，不能及時消化凋亡PMN，巨噬細胞對凋亡PMN的識別發(fā)生障礙等，將發(fā)生PMN壞死。4.通過生物分子交互作用分析系統測定PMN有SSTRl、SSTR2表達，SSTR是SST直接作用于PMN的主要途徑，是SST直接作用的分子靶點，說明SST的作用是通過SSTR實現的，本課題組采用先

17、進的方法對SST的作用及作用機制進行了研究，過去從未有該方面的研究報道，是本課題組的創(chuàng)新。5.MODS時獼猴血中性粒細胞凋亡抑制，中性粒細胞凋亡抑制在MODS發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。MODS時獼猴腹腔巨噬細胞凋亡增加，巨噬細胞凋亡增加在MODS發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。6.腸缺血再灌注后，PMN Bcl-2顆粒表達明顯增加，Bcl-2為凋亡抑制基因。7.腸缺血再灌注后，體內補體通過旁路途徑激活消耗，陽性Bcl-2顆粒表達明顯增加。IL-l

18、、NF-KB活性異常升高，導致大量促炎細胞因子的過度釋放，形成一個正反饋活化環(huán)致使炎癥反應持續(xù)并擴大，發(fā)揮放大機制,由此加重器官的組織損傷，炎癥失控，是MODS發(fā)生、發(fā)展的重要原因，最終導致MODS，研究中的獼猴因此無一例外地發(fā)生了MODS。8.SST組與ILR組比較，兩組補體、CRP沒有明顯的改變，體外實驗生長抑素不能抑制補體活性，生長抑素不能影響肝細胞對補體、CRP的合成。但腸缺血再灌注后24h，SST組與ILR組比較，獼猴腸、肺、