下調N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶-V對前列腺癌細胞放射治療和激素治療敏感性的影響.pdf

1、背景：
　　 前列腺癌是發(fā)生在男性中最常見的惡性腫瘤之一，并且隨著年齡的增長，其發(fā)病率越來越高。據報道，在20世紀80年代晚期以及90年代早期，美國新診斷的前列腺癌病例已超過肺癌作為男性中發(fā)病率最高的的腫瘤疾病。目前，前列腺癌的常見治療方法包括:根治性的手術、放療、內分泌治療、化療等。放射治療作為傳統(tǒng)治療手段之一，廣泛應用于不同分期的前列腺癌:早期前列腺癌的放射治療可以達到根治的目的，效果與根治性手術相似;局部晚期前列腺癌采取放

2、療結合內分泌治療可提高存活率;有遠處轉移者，姑息放療可以緩解局部癥狀，改善生活質量。但臨床發(fā)現部分病人因放療抵抗導致放療后局部復發(fā)，預后不佳。提高放射劑量可以減低腫瘤局部復發(fā)率，但是高劑量放療伴隨的副反應，如腸道損傷、泌尿系統(tǒng)受損、性功能障礙等，卻嚴重影響患者的生活質量。此外，內分泌治療是晚期前列腺癌姑息治療的主要方法，雖然最初可獲得很高的有效率，但是相當一部分病人在治療2-5年后病情進展為激素抵抗性前列腺癌（HRPC），最終導致治療失

3、敗。長時間內分泌治療誘導腫瘤細胞產生激素抵抗性的同時，對放射治療的耐受性同樣得到提高。因此，如何提高前列腺癌放射治療以及激素治療敏感性成為治療前列腺癌亟須解決的一個問題。
　　 生物體內的大多數蛋白質都是以糖蛋白的形式存在，而細胞表面糖蛋白寡糖鏈的結構重塑對糖蛋白功能起重要的作用，已發(fā)現，這些寡糖鏈與細胞的分化、粘附、增殖、腫瘤的侵襲和轉移密切相關。而寡糖鏈的產生、結構的改變是通過糖基轉移酶介導。越來越多的證據表明，與糖基轉移酶

4、基因的變化可以直接影響腫瘤組織細胞表型發(fā)生轉變。糖基轉移酶N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶(N-acetylglucosarninyl-transferase-Ⅴ，GnT-Ⅴ)為糖蛋白N-糖鏈加工酶之一，主要分布在高爾基體中，其作用為決定N-糖鏈類型及復雜型糖鏈結構，催化形成N-糖鏈的β-1，6分支。已發(fā)現GnT-Ⅴ對腫瘤的生長、轉移起重要作用。在許多惡性腫瘤組織中GnT-Ⅴ呈現高表達，提示不良的預后，如乳腺癌、結腸癌和肝癌。GnT-Ⅴ影響腫瘤

5、生物活性主要是通過改變β-1，6分支結構從而上調EGFR信號通路，抑制蛋白酶體的降解，抑制E-cadherin/β-catenin復合物功能，最終促進腫瘤的生長和轉移。
　　 盡管目前很多實驗表明GnT-Ⅴ和多種腫瘤的惡性生物學行為密切相關，但是尚未有研究報導GnT-Ⅴ和前列腺癌之間的關系。在本實驗中，我們主要關注GnT-Ⅴ的表達是否影響前列腺癌的生物學行為，并進一步探討其相關的內在機制。
　　 目的：
　　 此

6、前，本課題組通過體內、外實驗，比較干擾GnT-Ⅴ表達前后PC3細胞的增殖、凋亡情況，發(fā)現下調GnT-Ⅴ表達可以增加激素非依賴型前列腺癌細胞株PC3的放射敏感性，并進一步研究其中可能涉及的相關機制。但是GnT-Ⅴ表達與激素依賴型前列腺癌細胞的放射敏感性是否存在同樣關聯卻未被研究。在本實驗中，我們利用shRNA，構建低表達GnT-Ⅴ的激素依賴型前列腺癌細胞株LncapGnT-Ⅴ/1079以及Lncap GnT-Ⅴ/1564。通過體內及體外實

7、驗對比正常的Lncap細胞和低表達GnT-Ⅴ的Lncap細胞的放射敏感性差異。另外，本實驗還進一步探討GnT-Ⅴ與前列腺癌細胞(Lncap，PC3)激素治療敏感性的關系。最后，通過細胞周期、凋亡蛋白家族、細胞信號通路方面研究GnT-Ⅴ影響前列腺癌細胞放射敏感性、激素敏感性的內在機制。
　　 方法：
　　 1、pGPU6/GFP/Neo GnT-ⅤshRNA質粒的構建及鑒定:由上海吉瑪公司完成。
　　 2、細胞培養(yǎng)

8、及轉染人前列腺癌細胞株Lncap在37℃5％CO2條件下，培養(yǎng)于含10％新生牛血清的RPMI-1640中，每周傳代1-2次。Lneap細胞培養(yǎng)至對數生長期，參照invitrogen公司Lipofctamine2000TM產品說明書，用脂質體Lipofctamine2000TM將質粒導入Lncap細胞。用G418篩選陽性細胞克隆。
　　 3、干擾效果檢測
　　 (1) RT-PCR測定GnT-Ⅴ mRNA用Trizol提取

9、對數生長期的單層培養(yǎng)細胞總RNA，采用AMV逆轉錄合成cDNA.GnT-Ⅴ上游引物為5'GAGCAGATCCTGGACCTCAG3'，下游引物為5'GCTGTCATGACTCCAGCGTA3'。使用GAPDH作為內參，上游引物為5'AGAAGGCTGGGGCTCATTTG3'，下游引物為5'AGGGGCCATCCACAGTCTTC3'。反應條件為:95℃預變性30s，PCR:95℃5s，64℃34s，共40個循環(huán)，溶解曲線:95℃0s，

10、63℃60s，95℃0s.
　　 基于目的基因和看家基因實時熒光定量擴增曲線得到Ct(C為Cycle，t為threshold)值，△CT代表目的基因相對于內參基因的表達強度，公式為△CT=Ct目的基因-Ct內參基因。用Folds=2-△△Ct表示實驗組目的基因與對照組目的基因表達量的倍比關系，△△Ct=△CT實驗組-△CT對照組。目的基因為GnT-Ⅴ，內參基因為GAPDH。
　　 (2) Western blot檢測Gn

11、T-Ⅴ蛋白表達提取總蛋白，測定總蛋白濃度，吸取40μg總蛋白，去離子水補至20μL，加入1/4體積5×SDS上樣buffer煮沸5min，離心后吸取15μL上樣，經不連續(xù)SDS-PAGE電泳分離后，用半干法電轉移至PVDF膜上，5％脫脂奶粉37℃封閉2h，TBST洗膜后用羊抗人GnT-Ⅴ蛋白多克隆抗體(1∶200)、鼠抗人GAPDH蛋白單克隆抗體(1∶1000)4℃孵育過夜，洗膜后分別加入HRP標記的兔抗羊IgG(1∶1000)、HRP

12、標記的羊抗鼠IgG(1∶2000)，室溫下搖動1h，洗膜后用ECL化學發(fā)光系統(tǒng)檢測，暗室曝光X線片，沖洗膠片，UVI凝膠成像系統(tǒng)攝像，Image-Pro Plus6.0軟件分析條帶灰度值，用GnT-Ⅴ/GAPDH代表GnT-Ⅴ的相對表達量。
　　 4、pGPU6/GFP/Neo GnT-Ⅴ shRNA干擾后對前列腺癌細胞株Lncap放射敏感性的影響（體外實驗）
　　 (1)平板克隆形成實驗檢測pGPU6/GFP/Neo

13、GnT-Ⅴ shRNA干擾后對Lncap細胞照射后克隆形成能力的影響取各組對數生長期的待測細胞，接種于6孔板，每孔200個細胞，24h后分別給予0Gy,2Gy,4Gy,6Gy,8Gy五個劑量點照射，然后置于37℃5％CO2條件下靜止培養(yǎng)3周，待出現肉眼可見克隆時，終止培養(yǎng)，加入0.1％結晶紫染色，計數。通過克隆數計算出細胞生存分數。實驗分為Lncap組，Lncap GnT-Ⅴ/NC組，Lneap GnT-Ⅴ/1079組和Lncap Gn

14、T-Ⅴ/1564組，每組重復例數為9。
　　 (2) CCK-8法測定pGPU6/GFP/Neo GnT-ⅤshRNA干擾后對Lncap細胞單次6Gy照射后增殖能力的影響。
　　 取各組對數生長期的待測細胞，消化，制備單細胞懸液，計數，以每孔5×103個細胞接種到96孔板中，每組細胞6個復孔，鋪5塊板，置于37℃5％CO2條件下靜止培養(yǎng)，24h后給予6 Gy照射。照射后不同時間點(0h、24h、48h、72h、96h)分

15、別用CCK-8法檢測各組細胞活力。測量各組的OD450nm值，繪制生長曲線，并計算干擾組的生長抑制率。細胞生長抑制率(IR)=（對照組OD450值—干擾組OD450值）/對照組OD450值×100％。實驗分為Lncap組，LncapGnT-Ⅴ/NC組，Lncap GnT-Ⅴ/1079組和Lncap GnT-Ⅴ/1564組，每組重復例數為18。
　　 (3)劃痕實驗檢測pGPU6/GFP/Neo GnT-Ⅴ shRNA干擾后對Ln

16、cap、PC3細胞單次6Gy照射后遷移能力的影響。
　　 取各組對數生長期的待測細胞，接種到6孔板中，每孔5×105個細胞，置于37℃5％ CO2條件下靜止培養(yǎng)，待細胞融合率達100％時劃痕，并給予6 Gy照射。照射后不同時間點(0h、12h、24h、48h)在同一位置拍照，并用Image-ProPlus6.0軟件測量劃痕距離，計算劃痕愈合率。實驗分為Lncap組，LncapGnT-Ⅴ/NC組，Lncap GnT-Ⅴ/1079組

17、和Lncap GnT-Ⅴ/1564組;PC3組，PC3GnT-Ⅴ/NC組，PC3 GnT-Ⅴ/1079組和PC3 GnT-Ⅴ/1564組。每組重復例數為9。
　　 (4) Hoechst33258核染色及流式細胞術檢測pGPU6/GFP/Neo GnT-ⅤshRNA干擾后對Lncap細胞照射前后凋亡的影響。
　　 取對數生長期的細胞，分別給予0Gy及6Gy照射，72h后移去培養(yǎng)基，用1×PBS洗2次，4％多聚甲醛液室溫固

18、定20min，移去固定液，用PBS清洗2次，然后室溫孵育終濃度1ug/ml的Hoechst33258染色液5分鐘。孵育完畢后用PBS簡單清洗2次，吸盡液體，滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片。然后在熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)。實驗分為Lncap組Lncap GnT-Ⅴ/NC組和Lncap GnT-Ⅴ/1079組，每組重復例數為9。
　　 取對數生長期的細胞，分別給予0Gy及6Gy照射，72h后消化細胞，1×P

19、BS洗3遍，取1×105個細胞，加入195μL Annexinv PE結合液重懸細胞，再加入5μLAnnexinv PE和1μL7-AAD輕輕混勻，室溫避光孵育10分鐘。1000rpm/min離心5分鐘，棄上清，加入200μL Annexinv PE結合液重懸細胞，流式細胞儀檢測。實驗分為Lncap GnT-Ⅴ/NC組和Lncap GnT-Ⅴ/1079組，每組重復例數為9。
　　 (5)比色分析法測定Caspase-3活性取對數

20、生長期的細胞，分別給予6Gy照射，24、48、72h后，消化離心，PBS洗1次，離心，吸盡上清，按每200萬細胞加入100ul裂解液的比例加入預冷的裂解緩沖液冰上裂解細胞15min，期間渦旋振蕩34次，每次10s。4℃14000×g離心15min，收集上清測定蛋白濃度。取適量的待測樣品與Caspase-3底物DEVD-PNA以及檢測緩沖液混合，37℃孵育1-2h至顏色變化明顯，用96孔板在酶標儀405nm比色。PBS作為陰性對照組。干擾

21、組樣品OD(405nm)值與對照組樣品OD(405nm)值的比值為Caspase-3活性的百分率。實驗分為Lncap組，Lncap GnT-Ⅴ/NC組和Lncap GnT-Ⅴ/1079組，每組重復例數為9。
　　 (6)流式細胞術檢測pGPU6/GFP/Neo GnT-Ⅴ shRNA干擾對Lncap細胞照射后周期的影響。
　　 取各組對數生長期的待測細胞，分別給予0Gy，2Gy，6Gy，10Gy照射，24h后消化細胞，1

22、×PBS洗3遍，取1×106個細胞，加入2ml于-20℃預冷的70％乙醇，4℃冰箱過夜。染色前用PBS離心沉淀去除固定液，冷PBS洗2次。加入100μLRNA酶RNaseA，37℃水后冰上終止RNaseA作用。每ml細胞懸液加入50μg/ml碘化丙啶PI染色液I00μL混勻，37℃避光15min。流式細胞儀檢測。實驗分為Lncap GnT-Ⅴ/NC組和Lncap GnT-Ⅴ/1079組，每組重復例數為9。
　　 (7) West

23、ern blot檢測pGPU6/GFP/Neo GnT-Ⅴ shRNA對Lncap細胞照射前后凋亡相關蛋白的改變。
　　 提取總蛋白，測定蛋白濃度，吸取40μg總蛋白，去離子水補至20μL，加入5μL5×SDS上樣buffer煮沸5min，離心后吸取15μL上樣，經不連續(xù)SDS-PAGE電泳分離后，用半干法電轉移至PVDF膜上，5％脫脂奶粉37℃封閉2h，TBST洗膜后用羊抗人bax蛋白多克隆抗體(1∶200)、羊抗人bcl-2

24、蛋白多克隆抗體(1∶200)、羊抗人bcl-x1蛋白單克隆抗體(1∶200)、鼠抗人GAPDH蛋白單克隆抗體(1∶1000)4℃孵育過夜，洗膜后分別加入HRP標記的兔抗羊IgG(1∶1000)、HRP標記的羊抗鼠IgG(1∶2000)，室溫下搖動1h，洗膜后用ECL化學發(fā)光系統(tǒng)檢測，暗室曝光X線片，沖洗膠片，UVI凝膠成像系統(tǒng)攝像，Image-Pro Plus6.0軟件分析條帶灰度值，用bax/GAPDH代表bax的相對表達量，bcl-

25、2/GAPDH代表bcl-2的相對表達量，bcl-x1/GAPDH代表bcl-x1的相對表達量。實驗分為Lncap組，Lncap GnT-Ⅴ/NC組和LncapGnT-Ⅴ/1079組，每組重復例數為3。
　　 (8)雙熒光素酶實驗測定pGPU6/GFP/Neo GnT-Ⅴ shRNA對Lncap、PC3細胞照射前后NF-kB信號通路的改變。
　　 取對數生長期的待測細胞，消化、計數，鋪24孔板，每孔1×105個細胞，置于

26、37℃5％CO2條件下靜止培養(yǎng)。24h后行細胞轉染(0.9ug的PNF-kB-LUC+0.05ug PRL-CMV)。轉染后24h給予6Gy照射，照射后0h、6h行雙熒光素酶實驗，計算各組螢火蟲熒光值F/海腎熒光值。實驗分為Lncap組，Lncap GnT-Ⅴ/NC組和LncapGnT-Ⅴ/1079組;PC3組，PC3 GnT-Ⅴ/NC組和PC3 GnT-Ⅴ/1079組。每組重復例數為9。
　　 5、pGPU6/GFP/Neo

27、GnT-ⅤshRNA干擾后對前列腺癌細胞株Lncap放射敏感性的影響（體內實驗）
　　 (1)裸鼠成瘤實驗5周齡BALB/c裸鼠，雄性。每組各16只。細胞重懸于PBS，調整細胞濃度為5×107/ml，按100lμL/只進行臀部皮下注射。當腫瘤體積達200-300mm3，給予2Gy照射連續(xù)5天。照射后每隔3d測量腫瘤體積，按V=0.5ab2(V代表腫瘤體積，a為長徑，b為短徑)繪制生長曲線，并記錄裸鼠生存時間。
　　 (2

28、)生存分析每組取10只裸鼠，記錄每只裸鼠的生存天數。
　　 (3)免疫組化石蠟切片脫蠟和水化后，對組織抗原進行相應的修復。切片加內源性過氧化物酶阻斷劑，室溫下孵育5分鐘，加動物非免疫血清，室溫下孵育10分鐘。除去血清，每張切片加一滴一抗(GnT-Ⅴ蛋白多克隆抗體(1∶200)、Bax單克隆抗體(1∶200)、Bcl-2多克隆抗體(1∶200)、Bcl-xl多克隆抗體(1∶200))，4℃冰箱過夜，PBS液沖洗。之后切片滴加生物素

29、標記的二抗，室溫下孵育30分鐘，PBS液沖洗。每張切片加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫下孵育10分鐘。沖洗后滴新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察。蒸餾水沖洗，蘇木素復染，瀝干1分鐘后流水沖洗，鹽酸酒精分化，流水沖洗，烤干，封片。
　　 6、pGPU6/GFP/Neo GnT-ⅤshRNA干擾后對前列腺癌細胞株Lncap、PC3激素治療敏感性的影響。
　　 (1) CCK-8法測定pGPU6/GFP/Neo GnT-Ⅴ

30、shRNA干擾后對Lncap、PC3細胞氟他胺作用后增殖能力的影響。
　　 取各組對數生長期的待測細胞，消化，制備單細胞懸液，計數，以每孔5×103個細胞接種到96孔板中，每組細胞6個復孔，置于37℃5％CO2條件下靜止培養(yǎng)，24h后更換含不同濃度氟他胺(0umo1/l、10umol/l、20umol/l、50umol/l、100umol/l)的完全培養(yǎng)基。72h后分別用CCK-8法檢測各組細胞活力。測量各組的OD450nm值，

31、計算干擾組的生長抑制率。細胞生長抑制率（IR）=（對照組OD450值—干擾組OD450值）/對照組OD450值×100％。實驗分為Lncap組，Lncap GnT-Ⅴ/NC組和Lncap GnT-Ⅴ/1079組;PC3組，PC3 GnT-Ⅴ/NC組和PC3 GnT-Ⅴ/1079組。每組重復例數為18。
　　 (2) Western blot檢測pGPU6/GFP/Neo GnT-ⅤshRNA對Lncap、PC3細胞氟他胺作用前后

32、凋亡相關蛋白的改變。
　　 提取總蛋白，測定蛋白濃度，吸取40μg總蛋白，用PBS補至20μL，加入5μL5×SDS上樣buffer煮沸5min，離心后吸取15μL上樣，經不連續(xù)SDS-PAGE電泳分離后，用半干法電轉移至PVDF膜上，5％脫脂奶粉37℃封閉2h，TBST洗膜后用羊抗人bcl-2蛋白多克隆抗體(1∶200)、羊抗人bcl-xl蛋白多克隆抗體(1∶200)、羊抗人bax蛋白單克隆抗體(1∶200)、鼠抗人GAPDH

33、蛋白單克隆抗體(1∶1000)4℃孵育過夜，洗膜后分別加入HRP標記的兔抗羊IgG(1∶1000)、HRP標記的羊抗鼠IgG(1∶2000)，室溫下搖動1h，洗膜后用ECL化學發(fā)光系統(tǒng)檢測，暗室曝光X線片，沖洗膠片，UVI凝膠成像系統(tǒng)攝像，Image-Pro Plus6.0軟件分析條帶灰度值，用bax/GAPDH代表bax的相對表達量，bcl-2/GAPDH代表bcl-2的相對表達量，bcl-xl/GAPDH代表bcl-xl的相對表達量

34、。實驗分為Lncap組，Lncap GnT-Ⅴ/NC組和Lncap GnT-Ⅴ/1079組;PC3組，PC3 GnT-Ⅴ/NC組和PC3 GnT-Ⅴ/1079組。每組重復例數為3。
　　 (3)雙熒光素酶實驗測定pGPU6/GFP/Neo GnT-Ⅴ shRNA對Lncap、PC3細胞氟他胺作用前后WNT信號通路的改變。
　　 取對數生長期的待測細胞，消化、計數，鋪24孔板，每孔1×105個細胞，置于37℃5％CO2條件

35、下靜止培養(yǎng)。24h后行細胞轉染(0.9ug的PTCF4-LUC+0.05ug PRL-CMV)。轉染后24h更換含10umol/l的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，加藥后0h、72h行雙熒光素酶實驗，計算各組螢火蟲熒光值F/海腎熒光值。實驗分為Lncap組，Lncap GnT-Ⅴ/NC組和Lncap GnT-Ⅴ/1079組;PC3組，PC3 GnT-Ⅴ/NC組和PC3 GnT-Ⅴ/1079組。每組重復例數為9。
　　 7、統(tǒng)計學分析實驗結果均經

36、SPSS13.0軟件統(tǒng)計。所給數據為均數±標注差。以P＜0.05表示有統(tǒng)計學意義。實時定量RT-PCR、Westem-Blot實驗結果多組比較采用方差分析，多重比較采用LSD法。平板克隆實驗、CCK8細胞增殖實驗、劃痕實驗、細胞凋亡實驗、細胞周期實驗、雙熒光素酶實驗多組比較采用析因設計的方差分析，組內多重比較采用LSD法，兩組間的比較采用兩獨立樣本t檢驗。Caspase-3活性檢測實驗采用兩獨立樣本t檢驗。其中Western-Blot、

37、實時定量RT-PCR則取三次實驗結果的平均值，將實驗組換算成對照組的相對百分數進行統(tǒng)計。參數比較均先進行方差齊性檢驗，若方差不齊，用基于方差不齊的近似F檢驗Welch法。皮下成瘤試驗瘤體體積采用重復測量的方差分析，組內比較采用one-wayANOVA分析，組內的多重比較采用LSD法，兩組間的比較采用兩獨立樣本t檢驗;三組生存時間的比較采用Kaplan-Merer法分析。
　　 結果
　　 1、重組質粒的穩(wěn)定轉染質粒pGP

38、U6/GFP/Neo中含有編碼GFP的基因，故轉染細胞在熒光顯微鏡下可激發(fā)出綠色熒光。另外，質粒中的Neo基因同時賦予轉染細胞G418抗性。因此，通過脂質體Lipofectamine2000TM將含有GnT-Ⅴ shRNA的質粒導入Lncap細胞后，在熒光顯微鏡下觀察，所有轉染細胞均發(fā)熒光，并且可在含G418培養(yǎng)基中穩(wěn)定傳代，說明穩(wěn)定轉染成功。
　　 2、干擾效果檢測實時定量PCR實驗結果得出Lncap GnT-Ⅴ/1079和L

39、ncap GnT-Ⅴ/1564組細胞GnT-Ⅴ基因的mRNA表達較Lncap、Lncap GnT-Ⅴ/NC組明顯降低，表明轉染GnT-Ⅴ shRNA載體能抑制目的基因mRNA表達;Western blot結果也顯示轉染GnT-ⅤshRNA載體能抑制GnT-Ⅴ蛋白表達。Image-Pro Plus6.0軟件分析GnT-Ⅴ基因mRNA及蛋白的表達水平，按照公式進行計算后顯示Lncap GnT-Ⅴ/1079、Lncap GnT-Ⅴ/1564組

40、mRNA水平的抑制率分別為74％和64.3％，蛋白水平的抑制率分別為68.7％和54.7％，與Lncap、Lncap GnT-Ⅴ/NC組相比均有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。
　　 3、GnT-ⅤshRNA對細胞放療前后增殖、遷移能力的影響
　　 (1)、以細胞在不同照射劑量(0Gy2Gy,4Gy,6Gy,8Gy)的克隆形成率繪制細胞生存率曲線，Lncap GnT-Ⅴ/1079及Lncap GnT-Ⅴ/1564組的生存率

41、較Lncap組及Lncap GnT-Ⅴ/NC組低，說明下調GnT-Ⅴ的表達可進一步抑制Lncap細胞放療后的克隆形成能力。
　　 (2)、以細胞在6Gy放療后不同時間點(0h、24h、48h、72h、96h)繪制細胞生長曲線，Lncap GnT-Ⅴ/1079及Lncap GnT-Ⅴ/1564組的生長抑制率較Lncap組及Lncap GnT-Ⅴ/NC組高，可見下調GnT-Ⅴ的表達可增強放療對Lncap細胞的生長增殖抑制作用。

42、>　　 由于在既往實驗中，本實驗組尚未研究GnT-Ⅴ的表達與PC3細胞放療后遷移能力之間的關系，因此補充劃痕實驗，分析GnT-Ⅴ shRNA對Lncap、PC3細胞照射后遷移能力的改變。
　　 (3)、以細胞在6Gy放療后不同時間點(0h、12h、24h、48h)測量劃痕距離，Lncap GnT-Ⅴ/1564及Lncap GnT-Ⅴ/1079的劃痕愈合率較Lncap組及Lncap GnT-Ⅴ/NC組低;PC3 GnT-Ⅴ/15

43、64及PC3 GnT-Ⅴ/1079的劃痕愈合率較PC3組及PC3GnT-Ⅴ/NC組低，可見下調GnT-Ⅴ的表達可進一步抑制PCa細胞放療后的遷移能力。
　　 由于在檢測細胞增殖、遷移能力實驗上，Lncap GnT-Ⅴ/1079及Lncap GnT-Ⅴ/1564均較對照組Lncap及Lncap GnT-Ⅴ/NC低，而Lncap GnT-Ⅴ/1079與LncapGnT-Ⅴ/1564細胞之間的差別無統(tǒng)計學意義，但是Lncap GnT-

44、Ⅴ/1079細胞GnT-Ⅴ干擾效率更高，因此選擇Lncap GnT-Ⅴ/1079細胞進行后續(xù)實驗。
　　 4、GnT-Ⅴ shRNA對細胞放療前后凋亡的影響Hoechst33258核染色及流式細胞術AnnexinⅤ-PE/7-AAD法測定放射前后各組Lncap細胞的凋亡。結果顯示，放射治療前Lncap GnT-Ⅴ/NC組、Lncap GnT-Ⅴ/1079組細胞的凋亡率分別為:(1.30±0.26)％、(3.15±0.56)％;放

45、射治療后Lncap GnT-Ⅴ/NC組、Lncap GnT-Ⅴ/1079組細胞的凋亡率分別為:(9.66+0.73)％、(12.38+0.82)％。說明下調GnT-Ⅴ可提高Lncap細胞放療后的凋亡率。
　　 5、GnT-Ⅴ shRNA增加細胞放療敏感性可能涉及的機制
　　 (1)、以細胞在6Gy放療后不同時間點(0h、24h、48h、72h)檢測各組細胞的caspase-3活性，Lncap GnT-Ⅴ/1079組均高于

46、Lncap、Lncap GnT-Ⅴ/NC組，可見下調GnT-Ⅴ的表達可通過增加caspase-3活性從而提高Lncap細胞的放射敏感性。
　　 (2)、以細胞在不同劑量(0Gy,2Gy,6Gy,10Gy)照射后檢測各組細胞周期比例，可見Lncap GnT-Ⅴ/NC組細胞照射后出現明顯G2/M阻止;Lncap GnT-Ⅴ/1079組細胞照射后G2/M期阻止不明顯，推測下調GnT-Ⅴ的表達通過打破Lncap細胞放療誘導的G2/M期阻

47、止從而增加放療敏感性。
　　 (3)、以細胞在6Gy照射前后檢測凋亡相關蛋白表達水平，實驗結果表明，Lncap GnT-Ⅴ/1079組細胞在放射治療前后Bax表達量均高于Lncap及LncapGnT-Ⅴ/NC組;Bcl-2表達量均低于Lncap及Lncap GnT-Ⅴ/NC組;Bcl-x1三組無明顯差別?？梢娤抡{GnT-Ⅴ的表達通過增加Bax/Bcl-2比例增加Lncap細胞的放療敏感性。
　　 (4)、以細胞在6Gy照

48、射前后檢測NF-kB信號通路表達水平，Lncap GnT-Ⅴ/1079組細胞在放射治療前螢火蟲熒光值F/海腎熒光值低于Lncap及Lncap GnT-Ⅴ/NC組，放射治療后進一步增加與對照組的差距;PC3 GnT-Ⅴ/1079組細胞在放射治療后螢火蟲熒光值F/海腎熒光值低于PC3及PC3 GnT-Ⅴ/NC組，放射治療后進一步增加與對照組的差距?？梢娤抡{GnT-Ⅴ的表達可通過阻斷NF-kB信號通路從而增強PCa細胞的放療敏感性。
　

49、　 6、GnT-ⅤshRNA對裸鼠皮下成瘤實驗的影響
　　 (1)、X線照射后，Lncap GnT-Ⅴ/1079腫瘤體積增長較Lncap和Lncap GnT-Ⅴ/NC速度慢，差異顯著。Lncap GnT-Ⅴ/1079組裸鼠生存期較Lncap和LncapGnT-Ⅴ/NC長。
　　 (2)、免疫組化實驗示:Bcl-2表達于胞漿及細胞核中，Lncap GnT-Ⅴ/1079表達量低于Lncap GnT-Ⅴ/NC; Bax表達于

50、胞漿，Lncap GnT-Ⅴ/1079表達量高于Lncap GnT-Ⅴ/NC; Bcl-x1表達于胞漿，Lncap GnT-Ⅴ/1079及Lncap GnT-Ⅴ/NC表達量無明顯差異。
　　 (3)、從各組腫瘤組織中提取蛋白，行western blot檢測凋亡相關蛋白的表達水平，實驗結果顯示與Lncap及Lncap GnT-Ⅴ/NC組相比，Lncap GnT-Ⅴ/1079組表達Bax較高、Bcl-2較低、Bcl-xl無明顯差異。

51、
　　 此前，本實驗研究組主要關注GnT-Ⅴ與前列腺癌放射敏感性之間的關系，但是其與前列腺癌激素敏感性的關系尚未研究，因此，本實驗探討GnT-Ⅴ的表達能否影響PCa細胞(Lncap，PC3)激素敏感性，并從凋亡蛋白表達、細胞信號通路方面討論其中內在機制。
　　 7、GnT-Ⅴ shRNA對細胞激素治療敏感性的影響以細胞在不同濃度氟他胺(0umol/l、10umol/l、20umol/l、50umol/l、100umol/

52、l)作用后72h檢測各組細胞活力，計算生長抑制率，Lncap GnT-Ⅴ/1079的生長抑制率均較Lncap組及Lncap GnT-Ⅴ/NC組高，PC3 GnT-Ⅴ/1079的生長抑制率均較PC3組及PC3 GnT-Ⅴ/NC組高，可見下調GnT-Ⅴ的表達可增加PCa的激素敏感性。
　　 8、GnT-Ⅴ shRNA增加細胞激素敏感性可能涉及的機制
　　 (1)、以細胞在10umol/l氟他胺作用24h后提取蛋白，檢測凋亡相

53、關蛋白表達水平，實驗結果表明，Lncap GnT-Ⅴ/1079組細胞在藥物作用前后Bax表達量均高于Lncap及Lncap GnT-Ⅴ/NC組;Bcl-2表達量均低于Lncap及Lncap GnT-Ⅴ/NC組;Bcl-xl三組無明顯差別;PC3 GnT-Ⅴ/1079組細胞在藥物作用前后Bax表達量均高于PC3及PC3 GnT-Ⅴ/NC組;Bcl-2表達量均低于PC3及PC3 GnT-Ⅴ/NC組;Bcl-xl三組無明顯差別;可見下調GnT

54、-Ⅴ的表達通過增加Bax/Bcl-2比例增加PCa細胞的激素敏感性。
　　 (2)、以細胞在10umol/l氟他胺作用前后檢測WNT信號通路表達水平，結果發(fā)現Lncap GnT-Ⅴ/1079組細胞在氟他胺作用前后螢火蟲熒光值F/海腎熒光值均低于Lncap及Lncap GnT-Ⅴ/NC組;PC3 GnT-Ⅴ/1079組細胞在氟他胺作用前后螢火蟲熒光值F/海腎熒光值均低于PC3及PC3 GnT-Ⅴ/NC組，可見下調GnT-Ⅴ的表達可

55、通過阻斷WNT信號通路從而增加PCa細胞的激素敏感性。
　　 結論
　　 1、靶向GnT-Ⅴ的shRNA真核表達質?？梢燥@著下調GnT-Ⅴ的mRNA和蛋白表達。
　　 2、下調GnT-Ⅴ的表達可以提高PCa細胞的體外、體內放射敏感性。
　　 3、下調GnT-Ⅴ的表達提高PCa細胞放射敏感性的機制可能是通過抑制NF-kB信號通路表達，從而解除放療誘導的G2/M期阻止以及影響凋亡相關蛋白的表達。