轉(zhuǎn)基因玉米外源基因檢測(cè)方法研究.pdf

1、沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文轉(zhuǎn)基因玉米外源基因檢測(cè)方法研究姓名：肖一爭(zhēng)申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：唐詠20070601沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要本研究以6種轉(zhuǎn)基因玉米(MON810、Btll、Btl76、T25、GA21和NK603)為試驗(yàn)材料，研究適合的基因組DNA提取方法，建立和驗(yàn)證了轉(zhuǎn)基因玉米定性PCR檢測(cè)方法，并進(jìn)一步對(duì)擴(kuò)增的目的片段進(jìn)行克隆、測(cè)序和BLAST同源性分析，制備出轉(zhuǎn)基因玉米檢測(cè)陽性樣品。還利

2、用定性PCR檢測(cè)引物建立和優(yōu)化了復(fù)合PcR檢測(cè)體系，同時(shí)參考Kuntrudi等MQDAPCR文獻(xiàn)中設(shè)計(jì)的探針，將復(fù)合PCR和基因芯片結(jié)合起來，建立了高效、可靠的外源基因檢測(cè)方法。得到的結(jié)論如下：1、研究表明改良CTAB法提取的基因組DNA純度高、質(zhì)量好。用玉米內(nèi)參照基因引物擴(kuò)增改良CTAB法提取的基因組DNA，結(jié)果均為陽性，這能消除下游檢測(cè)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。2、本研究對(duì)Kuntrudi等MQDAPCR文獻(xiàn)中設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果表明

3、35S枷t、NoS—F瓜、BtllF／R、Btl76F／R、T25一F／R和MoN8lOF儂引物檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，可以用于轉(zhuǎn)基因玉米的定性檢測(cè)，而GA21F瓜引物檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定，本研究對(duì)其進(jìn)行了改進(jìn)，重新建立了穩(wěn)定的定性PCR檢測(cè)體系。3、本研究還通過查詢和收集轉(zhuǎn)基因玉米NK603外源基因的構(gòu)建信息，設(shè)計(jì)了NK603F／R結(jié)構(gòu)特異性引物，建立和優(yōu)化了轉(zhuǎn)基因玉米NK603定性PCR檢測(cè)方法。4、對(duì)8對(duì)定性PCR檢測(cè)引物擴(kuò)增得到的目的基因進(jìn)行回

4、收、克隆、測(cè)序與基因數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這些基因的特異片段就是檢測(cè)的目標(biāo)，因此可以將插入這些基因片段的質(zhì)粒作為檢測(cè)工作中的陽性對(duì)照。5、本研究利用定性PCR檢測(cè)的引物，設(shè)計(jì)和優(yōu)化了復(fù)合PCR反應(yīng)體系，能同時(shí)在一個(gè)PCR反應(yīng)中最多擴(kuò)增出6種轉(zhuǎn)基因玉米的特異性片段。6、利用Kuntrudi等MQDAPCR文獻(xiàn)中設(shè)計(jì)的探針，將復(fù)合PCR和基因芯片結(jié)合起來，同時(shí)檢測(cè)6種轉(zhuǎn)基因玉米的8個(gè)外源基因元件，包括CaMV35S基因、NOS基因、MaizeDN