鴨疫里默氏桿菌OmpA蛋白的免疫原性研究.pdf

1、鴨疫里默氏桿菌（Riemerella antipestifer,RA）能引起鴨、鵝、火雞等多種禽類發(fā)生鴨疫里默氏桿菌感染，呈急性或慢性敗血性經(jīng)過。本研究對RAOmpA基因開展了生物信息學分析、克隆表達、蛋白純化、多克隆抗體制備、基于OmpA蛋白間接ELISA方法的建立、重組蛋白免疫原性等研究，主要結果如下:
　　1 RA OmpA基因的生物信息學分析
　　RAOmpA全基因長1208bp，由397個氨基酸編碼大小為43.52

2、kDa的蛋白，等電點(pI)為4.81。該蛋白沒有信號肽切割位點和跨膜區(qū)，有如下功能位點:有4個N-糖基化位點，9個蛋白激酶C磷酸化位點，7個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點，3個N-豆蔻?；稽c。亞細胞定位分析該蛋白主要分布于外膜和細胞之內(nèi)。氨基酸進化樹分析表明該蛋白與黃桿菌科編碼OmpA蛋白的其它成員相似性低。該蛋白的抗原性分析表明第185-337位這段氨基酸有連續(xù)而且強烈的抗原性。
　　2 RA OmpA基因的克隆表達和多抗的制備

3、r>　　對RAOmpA基因設計了一對引物，大小為1208bp，構建pJET1.2/OmpA克隆載體及其pET32a(+)OmpA表達載體，轉入表達菌株BL21內(nèi)進行原核表達，優(yōu)化的表達條件:在37℃，IPTG終濃度為0.4mmol/L誘導4h的最優(yōu)條件下重組蛋白能夠大量表達。經(jīng)SDS-PAGE分析蛋白大小約63kDa，并主要以可溶性形式表達于上清，并用切膠的方法純化該蛋白。純化的蛋白用兔抗RAATCC菌為一抗，HRP-抗兔為二抗經(jīng)Wes

4、tern blot證實，該蛋白具有較好的反應原性。最后，將純化的蛋白制備兔抗多克隆抗血清，用瓊擴的方法測定效價為1∶16。
　　3基于OmpA蛋白間接ELISA方法的建立
　　用純化的重組蛋白作為包被抗原，用鴨抗RA ATCC全菌血清作為一抗，HRP-羊抗鴨為二抗進行條件的優(yōu)化，最后結果為，當包被的濃度為3.6125μg/mL;一抗最佳稀釋度為1∶100，最佳反應時間為1.5h;二抗最佳稀釋度1∶400，最佳反應時間為2h;

5、用1％BSA為封閉液;底物作用時間為30min時的反應條件最佳;并用優(yōu)化好的條件對26份陰性血清做了陰陽性臨界值確定，根據(jù)公式，當OD450＞0.379時可判為陽性，當OD450≤0.294時可判為陰性;重復性試驗結果表明變異系數(shù)均小于11％，表明該方法具有較好的重復性;對其它5種常見鴨病的陽性血清均無交叉反應性，說明具有較好的特異性。
　　4重組蛋白免疫原性的研究
　　用純化的重組蛋白作為免疫原，對雛鴨進行免疫，實驗分組: