Lewisy抗原通過PI3K-Akt及ERK-MAPK信號通路調控卵巢癌細胞增殖相關蛋白表達的機制研究.pdf

1、前言：
　　 卵巢癌的發(fā)生與發(fā)展是一個極其復雜的多因素的過程,目前對其發(fā)生機理尚不清楚。細胞膜表面有許多糖脂、糖蛋白構成的復合物,對細胞-細胞、細胞-分子的識別十分重要,參與信號轉導、粘附等分子相互作用,與細胞生長、凋亡、運動、分化等重要生命過程密切相關。細胞癌變后細胞膜上的糖復合物,特別是其糖鏈部分發(fā)生結構和量的變化。卵巢癌主要表現為Ⅱ型糖鏈的改變,如Lewisy抗原。研究表明75%的上皮性卵巢癌出現Lewisy不同程度的過量

2、表達,且表達增高的患者預后不良。我們在前期工作中利用基因轉染技術將人α1,2-巖藻糖轉移酶(α1,2-fucosyltransferase,α1,2-FT)基因轉入卵巢癌細胞系RMG-I,建立了Lewisy穩(wěn)定高表達卵巢癌細胞系RMG-I-H,發(fā)現轉染后RMG-I-H細胞對鉑類、紫杉醇及5-FU等化療藥物敏感性下降,提示Lewisy抗原具有提高卵巢癌細胞生存能力的作用。
　　 細胞表面的受體幾乎都是糖蛋白,研究表明,改變糖基轉移

3、酶的表達可影響細胞表面受體的糖鏈結構,繼而影響其表達數目及功能,促進細胞增殖。體細胞通過跨越緊密調節(jié)的細胞周期進行增殖和分化,細胞周期的調控涉及一系列調控蛋白,這些蛋白表達量及活性的變化在周期調控中極為重要。我們在前期工作中利用基因芯片技術檢測α1,2-FT基因轉染前后細胞系癌相關基因的表達差異,結果顯示轉染后細胞中有88種差異性表達基因,差異基因主要表現在細胞增殖、信號轉導、蛋白氨基酸磷酸化、轉錄、凋亡等方面。因此,我們推測Lewis

4、y可能作為信號轉導通路上的重要結構參與細胞內信號轉導,進而影響卵巢癌細胞的生物學行為。
　　 本研究主要在前期工作的基礎上,利用已經建立的α1,2-FT及Lewisy穩(wěn)定高表達細胞模型,探討Lewisy抗原促進卵巢癌細胞增殖的具體作用機制,為研究卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展機制奠定基礎,為卵巢癌的早期診斷及靶向治療提供理論依據。
　　 方法：
　　 第一部分:用RT-PCR、WesternBlot及免疫共沉淀等方法研究卵巢

5、癌細胞系RMG-I轉染α1,2-FT基因前后細胞中胰島素樣生長因子受體-1(Insulin-likegrowthfactorreceptor-1,IGFR-1)與Lewisy基因、蛋白的表達及兩者的結構關系,以及抗體阻斷前后IGFR-1酪氨酸磷酸化水平的變化;用免疫組化法檢測卵巢上皮性惡性、交界性、良性腫瘤和正常卵巢組織中Lewisy抗原與IGFR-1的表達及相關性,并分析其表達與卵巢癌組織學類型、病理分級、臨床分期及淋巴結轉移等病理參

6、數的關系;利用免疫熒光雙標記法檢測Lewisy抗原與IGFR-1在卵巢癌組織中表達的相關性。
　　 第二部分:利用流式細胞儀分析α1,2-FT基因轉染前后細胞的細胞周期;采用Real-timePCR方法檢測細胞中Cyclins,CDKs和CKIs的mRNA水平;利用WestemBlot方法檢測基因轉染前后、Lewisy抗體阻斷前后及信號通路抑制劑處理前后細胞中Cyclins,CDKs和CKIs的蛋白表達水平。
　　 第三

7、部分:利用RT-PCR、免疫印跡法方法檢測α1,2-FT基因轉染前后細胞中p27,p-p27,Skp2基因及蛋白的表達;采用免疫共沉淀方法檢測p27泛素化水平;利用Westernblot方法檢測P13K/Akt和ERK/MAPK信號通路抑制劑LY294002,PD98059和抗Lewisy單克隆抗體處理前后細胞中上述重要分子的變化。
　　 結果：
　　 第一部分:基因轉染后細胞系RMG-I-H中IGFR-1的基因和蛋白表

8、達水平均上調(P均＜0.01),但是,轉染后細胞中IGFR-1的酪氨酸磷酸化水平較轉染前升高更加明顯(P＜0.01)。免疫共沉淀證明Lewisy為IGFR-1結構上的重要組成部分,IGFR-1上的Lewisy總表達量為轉染前細胞的1.81倍,而相對表達量幾乎無變化(P＞0.05)。在卵巢上皮性惡性腫瘤中,Lewisy抗原的陽性表達率為88.33%,明顯高于交界性(60.00%)(P＜0.05)、良性(33.33%)(P＜0.01)及正常

9、卵巢組(0);Lewisy抗原的陽性表達率與卵巢癌臨床病理參數無關(P均＞0.05);IGFR-1在卵巢惡性上皮性腫瘤中的陽性表達率為93.33%,明顯高于交界性(63.33%)(P＜0.05)、良性(53.33%)(P＜0.05)和正常卵巢組(40%)(P＜0.01);IGFR-1的陽性表達率與臨床分期、組織學類型、分化程度及有無淋巴結轉移無關(P均＞0.05);在卵巢癌中,Lewisy抗原和IGFR-1的表達水平隨臨床分期的增加、分

10、化程度的降低而增加,但無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),與組織學類型及有無淋巴結轉移無關(P＞0.05);Lewisy抗原和IGFR-1在卵巢癌組織中同時高表達,且其表達具有正相關性(P＜0.01)。
　　 第二部分:Lewisy抗原能夠加快卵巢癌細胞由G1期進入S期。Lewisy高表達導致卵巢癌細胞中CyclinA,CyclinD1和CyclinEmRNA及蛋白表達增加,而p16、p21mRNA及其蛋白表達減少,p27僅蛋白表達降

11、低,其mRNA表達沒有改變;CDK2,CDK4和CDK6的mRNA及其蛋白水平在基因轉染前后沒有變化。Lewisy抗體、ERK和PI3K通路抑制劑PD98059和LY294002能夠減少Lewisy高表達引起的Cyelins和CKIs表達差異。
　　 第三部分:Lewisy高表達導致p27的核漿分布比例下降,p27蛋白穩(wěn)定性下降,p27多聚泛素化及p27-Thr187磷酸化水平上調,CDK2活性增強及Skp2表達增加均加快p27

12、蛋白降解,從而導致p27蛋白穩(wěn)定性降低。Lewisy單克隆抗體阻斷可以減少轉染前后卵巢癌細胞中p27和Skp2的表達差異。PI3K/Akt通路較ERK/MAPK通路在Lewisy調節(jié)p27和Skp2的表達方面起主要作用。
　　 結論：
　　 1、Lewisy抗原和IGFR-1表達增加與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展相關;
　　 2、Lewisy是IGFR-1的重要結構;其高表達不僅增加IGFR-1的數量,還上調IGFR-1酪