胃食管反流病內臟高敏的外周機制的研究.pdf

1、研究目的
　　 目前研究發(fā)現(xiàn)食管痛覺高敏在GERD發(fā)病中發(fā)揮關鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，GERD患者食管粘膜中的炎癥介質可降低辣椒素受體(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)、酸敏感離子通道3(acid-sensing ion channels 3，ASCI3)等酸敏感受體的信號轉導閾值，從而介導外周致敏，引起食管粘膜的酸痛覺高敏現(xiàn)象，是50％以上GRED患者雖無過度酸反流，但仍

2、有典型反酸、燒心、胸骨后不適等癥狀的重要發(fā)病因素。而參與GERD患者食管痛覺高敏感形成的有關受體蛋白以及如何行有效的干預治療仍未明。
　　 內源性大麻素系統(tǒng)是疼痛領域的關注熱點，內源性大麻素(anandamide，AEA)可通過分別激活大麻素受體1，2(cannabinoid receptor 1&2，CB1&CB2)或TRPV1受體在疼痛調控中發(fā)揮雙向調節(jié)作用。但內源性大麻素在食管痛覺高敏感形成和維持中機制未明。因此，本研究旨

3、在進一步探討GERD的發(fā)病機制，擬明確內源性大麻素AEA在NERD食管痛覺高敏中所發(fā)揮的作用及機制。
　　 研究方法
　　 雄性SD大鼠，體重200-250g。采用限制幽門及結扎胃底方法建立RE大鼠模型。假手術組大鼠開腹后分離胃底及幽門后即關腹。分別于術后7d、10d、15d取材食管下段組織，行蘇木素伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色及病理評分來判斷食管粘膜損傷程度；統(tǒng)一于術后10d取材T1-T

4、3節(jié)段背根神經節(jié)采用免疫熒光及Westernblot方法觀察TRPV1及CB1、CB2受體的表達變化，并將TRPV1、CB1、CB2的Westemblot結果行相關性分析。
　　 選擇SPSS16.0軟件行統(tǒng)計學分析，P＜0.05被認為有統(tǒng)計學差異。
　　 研究結果
　　 1、慢性反流性食管炎大鼠模型的建立
　　 胃底結扎及幽門限制術可成功建立RE大鼠模型，并符合胃內容物反流入食管刺激食管下段產生反流癥狀

5、的機制。術后15d取材發(fā)現(xiàn)，食管炎發(fā)生率為100％，組織學改變主要有：鱗狀上皮基底細胞增生明顯，基底層不同程度增厚，占整個鱗狀上皮厚度的16％以上(正常不超過15％)。粘膜固有層乳頭向上皮腔面延長，超過上皮厚度的2/3(正常不超過1/2)。固有層內炎性細胞浸潤，早期為以中性粒細胞浸潤，伴纖維素形成；隨術后時間延長，逐漸轉變?yōu)槁匝装Y表現(xiàn)，以淋巴細胞浸潤為主，粘膜下層小靜脈擴張，毛細血管增多。食管鱗狀上皮細胞汽球樣變，胞漿淡染呈空泡狀，核

6、不規(guī)則或濃縮狀。對照組大鼠食管粘膜無明顯病理改變。
　　 2、TRPV1在RE大鼠的DRG及食管粘膜中表達上調
　　 造模后10d取材，蛋白定量檢測顯示RE組大鼠DRG中TRPV1蛋白表達上調，其相對于內參GAPDH的灰度值為0.98±0.01，高于假手術組的0.64±0.09(P=0.001)。免疫熒光結果示TRPV1表達于DRG中的小直徑神經元。高倍鏡下計數(shù)大鼠DRG中TRPV1表達的陽性百分比：RE組共計數(shù)2019

7、個神經元，共有1608個神經元表達陽性，陽性百分比為79.64％(72.11～87.69％)；假手術組共計數(shù)2643個神經元，共計1026個陽性神經元，陽性百分比為38.82％(36.00～41.84％)(P=0.000)，RE組大鼠TRPV1表達的陽性百分比高于假手術組。RE組大鼠DRG中TRPV1的累積熒光密度亦高于假手術組，分別為905.24±134.82，648.43±135.13(P=0.000)。
　　 蛋白定量檢測

8、顯示RE組大鼠食管粘膜中TRPV1蛋白表達上調，其相灰度值為0.92±0.06，高于假手術組的0.70±0.10(P=0.001)。免疫熒光結果示TRPV1免疫反應陽性位于食管粘膜層乳頭結構內及粘膜下層。
　　 3、CB1、CB2在RE大鼠的DRG及食管粘膜中表達降低
　　 造模后10d取材，DRG中蛋白定量檢測顯示RE組大鼠CB1蛋白表達下調，其相對于內參GAPDH的灰度值為0.86±0.05，假手術組為0.96±0.

9、06(P=0.013)。免疫熒光結果示CB1受體在DRG不同直徑神經元均有陽性表達。高倍鏡下計數(shù)大鼠DRG中CB1表達的陽性百分比：RE組共計數(shù)1492個神經元，共有1190個神經元表達陽性，陽性百分比為60.25％(57.28～65.23％)；假手術組共計數(shù)1429個神經元，共計1227個陽性神經元，陽性百分比為82.24％(79.71～83.67％)(P=0.000)，RE組大鼠CB1表達的陽性百分比低于假手術組。RE組大鼠DRG中

10、CB1的累積熒光密度亦低于假手術組，分別為677.06±123.75，836.89±101.00(P=0.013)。
　　 食管粘膜中RE組大鼠的CB1蛋白表達降低，其相灰度值為0.76±0.03，假手術組為0.94.±0.04(P=0.000)。
　　 DRG中RE組大鼠的CB2蛋白表達下調，其相對于內參GAPDH的灰度值為0.75±0.03，假手術組為0.81±0.05(P=0.019)。免疫熒光結果示CB2受體在D

11、RG大直徑神經元表達陽性。高倍鏡下計數(shù)大鼠DRG中CB2表達的陽性百分比：RE組共計數(shù)1988個神經元，共934個神經元表達陽性，陽性百分比為46.98％(44.55～48.59％)；假手術組共計數(shù)1560個神經元，共計1150個陽性神經元，陽性百分比為73.72％(66.67～77.30％)(P=0.000)，RE組大鼠CB2表達的陽性百分比低于假手術組。RE組大鼠DRG中CB2的累積熒光密度亦低于假手術組，分別為513.99±79.

12、80,709.63±43.25(P=0.000)。
　　 食管粘膜中RE組大鼠的CB2蛋白表達亦降低，其相灰度值為0.80+0.17，假手術組為0.96±0.05(P=0.040)。
　　 TRPV1與CB1在RE大鼠DRG中呈負相關(r=-0.606，P=0.037)；在食管粘膜中蛋白表達亦負相關(r=-0.836，P=0.001)。
　　 結論
　　 1、“幽門限制加胃底結扎術”可成功建立慢性反流性食