基于樹突狀細胞的膀胱腫瘤疫苗的實驗研究.pdf

1、膀胱腫瘤是我國泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤，其中多數(shù)為非肌層浸潤性膀胱癌。膀胱腫瘤的主要特點是復發(fā)率高，可能的原因是膀胱腫瘤患者膀胱粘膜局部免疫功能低下，使得殘存腫瘤容易逃避免疫監(jiān)視，得以生存和形成復發(fā)。因此，非肌層浸潤性膀胱腫瘤術后常輔以膀胱灌注化療或免疫療法以預防腫瘤復發(fā)和進展?？ń槊?BacillusCalmette-Guerin，BCG)膀胱灌注是目前投入臨床應用最有效的免疫治療方法，有效激活膀胱粘膜局部免疫應答是其抗腫瘤作用的主要機制

2、，但BCG膀胱灌注等治療仍不能完全預防腫瘤的復發(fā)和進展。預防膀胱腫瘤復發(fā)和進展仍是尚未完全解決的難題。 樹突狀細胞(DC)是目前發(fā)現(xiàn)的體內功能最強，也是唯一能激活初始型T淋巴細胞的抗原遞呈細胞(APC)。DC在腫瘤免疫中的功能強大，但腫瘤組織及外周血中DC的數(shù)目、成熟及功能受到抑制。隨著體外大量擴增DC和制備DC疫苗技術的日趨成熟，采用DC疫苗進行抗腫瘤治療已成為當今腫瘤生物治療領域倍受關注的焦點之一。 環(huán)氧化酶2(CO

3、X-2)是一種誘導型酶，正常組織幾乎無表達，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關，對腫瘤的分化、凋亡、血管生成等生物學行為產(chǎn)生影響，且與腫瘤分級分期、進展預后等有關。因此，近年來，COX-2抑制劑作為膀胱腫瘤治療的新型途徑，獲得了廣泛的關注。我們試驗組也進行了大量相關的研究工作，發(fā)現(xiàn)COX-2抑制劑對膀胱腫瘤有明顯的殺傷與抑制增殖的作用，同時對DC細胞具有很強的誘導作用。 CpG是卡介苗(BCG)中提取的DNA片段，以未甲基化胞嘧啶鳥嘌呤

4、(CpG)二核苷酸為核心的六堿基序列為基礎，具有強大的免疫刺激活性。人工合成的含CpG序列的寡脫氧核糖核苷酸(CpG-ODN)具有與細菌DNA相同的免疫活性，可與DC表面TLR-9受體特異性結合，激活DC，上調共刺激分子的表達、增強DC向T細胞遞呈抗原的能力，可以替代BCG使DC成熟獲得抗原遞呈和刺激免疫的功能。 本實驗組近年來在COX-2與膀胱腫瘤的相關研究以及CpG-ODN聯(lián)合DC疫苗的研究都進行了大量的工作，本課題是本實驗

5、室前期相關研究延續(xù)和深入。課題研究的目的在于建立以DC為基礎，以COX-2抑制劑和免疫佐劑CpG-ODN刺激誘導其成熟并發(fā)揮免疫功能的膀胱腫瘤疫苗，研究其對膀胱腫瘤的生物學效應，為尋找一種新的治療膀胱癌和預防其復發(fā)的方法奠定實驗基礎。 本研究主要研究內容及結果如下： 第一部分基于DC的膀胱腫瘤疫苗的建立及其形態(tài)與功能的初步鑒定。 目的：建立基于DC的膀胱腫瘤疫苗并進行初步鑒定。 方法： 1.從人臍

6、血中分離單個核細胞，體外誘導培養(yǎng)為樹突狀細胞(DC)，加入COX-2抑制劑塞來昔布和免疫佐劑CpG-ODN，刺激使其成熟，制備膀胱腫瘤疫苗。觀察其形態(tài)并對其表面標志進行檢測。 2.ELISA法測定各組培養(yǎng)上清中Th1型細胞因子(IL-12)和Th2型細胞因子(IL-10)水平。 3.MTT法測定各組DC的同種異體混合淋巴細胞反應性。 結果和結論： 1.經(jīng)鑒定建立的以DC為基礎的膀胱腫瘤疫苗具有典型DC形態(tài)

7、學和表型特征。 2.細胞因子檢測結果顯示BCG激活DC后IL-12和IL-10水平均較對照組顯著升高，表明BCG既激活了Th1型，也激活了Th2型免疫應答，而加入塞來昔布的2組DC的細胞因子IL-12分泌顯著增加而IL-10表達明顯下降，證實了塞來昔布引起的免疫漂移現(xiàn)象。同時，應用佐劑CpG-ODN也可以見到IL-12的分泌明顯增加，但對IL-10的分泌沒有明顯影響。 3.同種異體混合淋巴細胞反應性檢測結果顯示，實驗組M

8、LR明顯比對照組增強。 這些結果都初步顯示了我們制備的DC疫苗具有更強的抗原遞呈效應和誘導機體免疫的效應，為我們進一步驗證DC疫苗的生物效應和動物試驗打下了良好的基礎。 第二部分 DC疫苗對體外培養(yǎng)的膀胱腫瘤細胞株T24的免疫學效應研究。 目的：觀察建立的DC疫苗對體外培養(yǎng)的膀胱腫瘤T24細胞的免疫治療效應。 方法： 1.制備DC疫苗激活的細胞毒T淋巴細胞(CTL)；復蘇和培養(yǎng)人膀胱腫瘤T24細胞

9、作為CTL的靶細胞。 2.將貼壁生長的T24細胞，分別與各組DC疫苗共培養(yǎng)，乳酸脫氫酶(LDH)釋放法測定各組DC激活的細胞毒T淋巴細胞(CTL)對人膀胱腫瘤細胞株T24的細胞毒活性。 結果和結論： 1.成功復蘇和擴增了靶細胞T24，成功獲得了DC疫苗激活的細胞毒T淋巴細胞(CTL)。 2.LDH釋放法測定各組DC激活CTL對人膀胱腫瘤細胞株T24的細胞毒活性，我們制備的DC疫苗激活CTL，產(chǎn)生很強的抗膀

10、胱腫瘤細胞毒活性的效應。 隨著效/靶比提高，細胞毒活性辦相應加強。由此可以推斷我們制備的DC疫苗可能成為膀胱腫瘤的有效治療方法。 第三部分負載腫瘤抗原的DC疫苗對T739小鼠體內膀胱腫瘤的免疫學效應研究。 目的：觀察建立的DC疫苗對BTT739膀胱腫瘤荷瘤小鼠體內膀胱腫瘤的免疫治療效應。 方法： 1.采用細胞懸液法建立BTT739膀胱腫瘤荷瘤小鼠模型，分別于接種腫瘤細胞后第7天和14天，應用負載腫

11、瘤抗原的DC疫苗腫瘤周圍注射，觀察腫瘤的體積、瘤重、荷瘤小鼠的生存期等變化。 2.經(jīng)負載腫瘤抗原的DC疫苗治愈的2只小鼠，30天后仍無腫瘤生長，再次皮下接種BTT739細胞，觀察腫瘤生長情況。 結果和結論： 1.負載腫瘤抗原的DC疫苗實驗組荷瘤鼠腫瘤平均體積和平均瘤重均顯著低于對照組(P<0.01)，生存期長于對照組，并且有2只小鼠無瘤長期存活；負載腫瘤抗原的DC疫苗聯(lián)合CpG-ODN對膀胱腫瘤荷瘤小鼠具有抑瘤效

12、應和生存期延長作用。 2.經(jīng)DC疫苗實驗組治愈的2只小鼠30天后無腫瘤生長，再次皮下接種BTT739細胞觀察30天仍無腫瘤發(fā)生。我們建立的DC疫苗對膀胱腫瘤細胞再次攻擊具有免疫保護作用，其機制可能是誘導機體產(chǎn)生了長期的腫瘤記憶性細胞免疫反應，在膀胱腫瘤復發(fā)預防中具有良好應用前景。 全文結論： 1.建立了以DC為基礎，以COX-2抑制劑和免疫佐劑CpG-ODN刺激其誘導成熟的膀胱腫瘤疫苗，其具有和普通DC相同的細胞