駱駝源和竹鼠源隱孢子蟲的分離鑒定及種系發(fā)育分析.pdf

1、隱孢子蟲是一種危害嚴重的細胞內寄生原蟲，它主要造成宿主不同程度的腹瀉，其寄生范圍很廣，能感染包括人在內的260多種脊椎動物。研究發(fā)現(xiàn)，野生動物是隱孢子蟲重要儲存宿主，目前研究人員已在不同種類的野生動物身上發(fā)現(xiàn)了多個蟲種。本實驗嘗試采用飽和蔗糖漂浮法，從兩個黑熊養(yǎng)殖場、成都動物園、碧峰峽野生動物園、貴陽動物園、竹鼠養(yǎng)殖場的野生動物和從成都及雅安地區(qū)的大熊貓采集到的共1370份糞便樣品中分離隱孢子蟲;結合形態(tài)學和分子方法對其進行蟲種鑒定，再

2、分別采用MLST技術和gp60位點進行亞型鑒定;并對各基因位點測序獲得的序列進行同源性分析和構建進化樹，研究卵囊所屬種類和基因分型地位。
　　結果顯示，本實驗共分離得到一株駱駝源隱孢子蟲和三株竹鼠源隱孢子蟲。分離得到的駱駝源隱孢子蟲卵囊在飽和蔗糖溶液中呈現(xiàn)淡紫色，殘留體透明卵囊呈圓形或卵圓形。400×光鏡下平均每個視野可觀察到3個卵囊，測量50個卵囊其平均大小為7.03(5.87～7.95)×5.50(4.60～6.00)μm(n

3、=50)。運用巢式PCR擴增出駱駝源隱孢子蟲SCBC02分離株18SrRNA、COWP、CpA135三個基因位點序列，測序結果經矯正后提交到Genbank獲得登錄號。序列同源性分析得出，該分離株在三個基因位點上均與Cryptosporidium andersoni參考序列同源性最高?；贜-J法構建三個位點進化樹得出，SCBC02分離株均與Candersoni處于同一分支。最后我們結合鏡檢觀察和全部三個位點序列系統(tǒng)發(fā)育分析判斷該分離株屬

4、于安氏隱孢子蟲。利用MLST(multilocussequence typing)方法對其亞型進行鑒定，MS1、MS2、MS3、MS16位點亞型鑒定結果分別為A4、A4、A4、A1，與四川地區(qū)奶牛常見隱孢子蟲亞型相同。我們推斷，駱駝與奶牛之間可能存在隱孢子蟲相互傳播。將卵囊口服接種至免疫抑制狀態(tài)下的昆明系鼠、SD大鼠和倉鼠，并連續(xù)30 d對這些實驗動物的糞便進行隱孢子蟲卵囊檢測，均未發(fā)現(xiàn)蟲卵，顯示感染不成功。
　　從竹鼠分離得到三

5、株隱孢子蟲(YA01、YA02、YA03)，形態(tài)相似，在飽和蔗糖溶液中呈現(xiàn)淡紫色，殘留體透明卵囊呈圓形或卵圓形。將擴增出的18S rRNA、COWP、CpA135、HSP70、actin位點序列矯正后提交到Genbank并獲得登錄號。經同源性分析發(fā)現(xiàn)，在18S rRNA位點YA01、 YA02、YA03之間沒有差異，全部與Cryptosporidium parvum有100％同源性;COWP位點YA03與YA01和YA02有0.3％的差

6、異，YA01、YA02間沒有差異，但都與C.parvum同源性最高;HSP70位點YA01、YA03之間沒有差異，YA02與另外兩株之間存在0.2％的差異;actin位點克隆后測序，分析得出，YA01、YA02、 YA03之間均有差異，與C.parvum參考序列同源性分別為99.7％、99.2％、99.4％; CpA135位點YA01與YA02相同，它們與YA03同源性為99.3％。構建進化樹觀察到，三株竹鼠源隱孢子蟲在所有位點均與C.

7、parvum處于同一分支。綜合形態(tài)學和分子分型，我們鑒定三株隱孢子蟲均為微小隱孢子蟲。利用gp60位點對三株隱孢子蟲亞型鑒定并命名為ⅡpA9、ⅡpA9、ⅡoA13G1，其中YA01(ⅡpA9)、YA02(ⅡpA9)為新的亞型。
　　綜上所述，本試驗是四川地區(qū)首次檢測到駱駝感染隱孢子蟲，關于駱駝源隱孢子蟲開展的各項實驗，豐富了我國駱駝人獸共患寄生蟲病研究工作;本實驗同時也是世界上首次分離得到三株竹鼠源隱孢子蟲，填補了竹鼠隱孢子蟲病研