人類bFGF基因在大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的表達及其分子作用機制研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:構(gòu)建bFGF表達載體,轉(zhuǎn)染大鼠MSC和大鼠成骨細胞,RT-PCR半定量研究bFGF表達與VEGF,LMP-1及BGP基因表達的關(guān)系.方法:將質(zhì)粒pCI-neo-bFGF轉(zhuǎn)化擴增,大量提取及純化.用雙酶切定向構(gòu)建pIRES2-EGFP-bFGF質(zhì)粒表達載體,擴增并酶切鑒定.使用電穿孔儀將攜帶目的基因的pIRES2-EGFP-bFGF轉(zhuǎn)染MSC和大鼠成骨細胞,熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果,流式細胞儀(flow cytometry,FCM)

2、檢測轉(zhuǎn)染效率,RT-PCR鑒定轉(zhuǎn)染細胞中的bFGF的轉(zhuǎn)錄,免疫組化檢測蛋白水平bFGF的表達和VEGF的表達,半定量PCR觀測bFGF與VEGF,LMP-1及BGP的轉(zhuǎn)錄水平關(guān)系.結(jié)果:成功構(gòu)建pIRES2-EGFP-bFGF,電穿孔儀有效地將質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)入MSCs和OB,熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白(green fluorescence protein,GFP)表達,流式細胞儀觀測,MSCs電穿孔轉(zhuǎn)染效率達到14.9%,OB的轉(zhuǎn)染效率2

3、7%;免疫組織化學(xué)檢測和RT-PCR檢測成功檢測到bFGF的轉(zhuǎn)錄和表達,半定量PCR發(fā)現(xiàn),bFGF的表達與VEGF的表達呈相關(guān)性,與BGP,LMP-1表達無關(guān).結(jié)論:bFGF基因轉(zhuǎn)染MSCs,可以有效的上調(diào)VEGF的表達,bFGF與VEGF得以聯(lián)合發(fā)揮作用,促進了內(nèi)皮細胞的增殖,但是,bFGF對成骨細胞及MSCs中LMP-1、BGP(骨鈣素)的表達沒有影響,不能促進成骨細胞及MSCs向成骨方向分化,因此,在未來的MSCs轉(zhuǎn)基因治療中,同

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