Bt毒蛋白在“轉(zhuǎn)Bt水稻—稻縱卷葉螟—縱卷葉螟絨繭蜂”食物鏈中的傳遞和作用機(jī)制.pdf

1、水稻作為人類主要口糧之一，轉(zhuǎn)基因水稻安全性倍受關(guān)注，有關(guān)轉(zhuǎn)基因水稻生態(tài)安全性研究尤為必要。因此，在轉(zhuǎn)基因水稻商業(yè)化生產(chǎn)之前，進(jìn)行系統(tǒng)、科學(xué)的生態(tài)安全性評(píng)價(jià)刻不容緩。本論文以轉(zhuǎn)crylAb基因粳稻純合品系“克螟稻1號(hào)(KMD1)”和“克螟稻2號(hào)(KMD2)”為材料，通過(guò)室內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)了轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻對(duì)靶標(biāo)生物稻縱卷葉螟及其天敵縱卷葉螟絨繭蜂的生態(tài)安全性影響以及對(duì)稻田生境內(nèi)節(jié)肢動(dòng)物群落多樣性的影響。結(jié)果如下： 1 轉(zhuǎn)crylAb基

2、因抗蟲粳稻對(duì)靶標(biāo)害蟲稻縱卷葉螟取食、生長(zhǎng)及存活的影響 連續(xù)取食轉(zhuǎn)crylab基因的水稻后，不同齡期的稻縱卷葉螟幼蟲食物的消耗量都顯著的低于取食對(duì)照水稻“秀水11”的幼蟲的消耗量。稻縱卷葉螟幼蟲在對(duì)照水稻“秀水11”上連續(xù)取食時(shí)，食物的消耗量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。當(dāng)幼蟲取食轉(zhuǎn)Bt基因的水稻“KMD1”時(shí)，不同齡期的變化趨勢(shì)有所不同，3 齡幼蟲取食水稻的食物消耗量隨時(shí)間的變化也有所不同于4齡和5齡，3齡幼蟲在取食后食物消耗量有先減再

3、稍微增的趨勢(shì)，而4齡和5齡老熟的幼蟲則表現(xiàn)為先增加再略微減少的趨勢(shì)。取食轉(zhuǎn)crylAb基因的水稻后，稻縱卷葉螟3齡，4齡和5齡的幼蟲體重都出現(xiàn)了負(fù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，取食對(duì)照水稻“秀水11”的幼蟲則表現(xiàn)出體重的正增長(zhǎng)。取食轉(zhuǎn)Bt基因的水稻后，稻縱卷葉螟3齡，4齡和5齡的幼蟲分別都表現(xiàn)出了較高的相對(duì)死亡率，其中3齡，4齡和5齡幼蟲在取食轉(zhuǎn)Bt基因水稻72小時(shí)后的相對(duì)死亡率分別為81％，77％和68％。表明低齡幼蟲比高齡幼蟲對(duì)轉(zhuǎn)Bt基因水稻顯得更加

4、敏感。 2 轉(zhuǎn)crylab基因抗蟲粳稻對(duì)靶標(biāo)害蟲稻縱卷葉螟組織病理學(xué)效應(yīng) 稻縱卷葉螟幼蟲取食了轉(zhuǎn)CrylAb基因的水稻后，中腸上皮細(xì)胞的線粒體先發(fā)生形態(tài)變化，隨取食時(shí)間的延長(zhǎng)，線粒體出現(xiàn)凝聚、內(nèi)嵴破壞、空泡化等。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的變化也很明顯，病變過(guò)程中伴隨著粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的腫脹、核糖體脫落等。此外，在病變過(guò)程中，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)了粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多等現(xiàn)象。組織病變程度不一，有的細(xì)胞在病變?cè)缙诰统霈F(xiàn)了空泡化。細(xì)胞核的變化較小，在處理后期出現(xiàn)細(xì)

5、胞核拉長(zhǎng)、核仁聚集等變化。杯狀細(xì)胞的杯腔底部的細(xì)胞質(zhì)突起變化很明顯，表現(xiàn)為突起拉長(zhǎng)，脫落成膜性結(jié)構(gòu)，最后破碎，消失，線粒體則呈凝聚態(tài)隨突起脫落或沿杯腔邊沿單一排列。 3 轉(zhuǎn)crylab基因抗蟲粳稻對(duì)靶標(biāo)害蟲稻縱卷葉螟中腸血淋巴糖代謝和蛋白質(zhì)濃度的影響 取食轉(zhuǎn)crylab基因水稻的稻縱卷葉螟幼蟲，在取食12h，24h，36h后的5齡幼蟲血淋巴的濃度顯著低于對(duì)照，3齡幼蟲和5齡幼蟲其他取食時(shí)間的血淋巴的總蛋白濃度均低于取食對(duì)

6、照水稻“秀水11”的幼蟲血淋巴總蛋白濃度，但差異不顯著。取食轉(zhuǎn)Bt基因水稻的稻縱卷葉螟幼蟲無(wú)論是3齡幼蟲還是5齡幼蟲血淋巴總糖含量均低于取食對(duì)照水稻秀水11，差異不顯著。取食轉(zhuǎn)Bt基因水稻的稻縱卷葉螟幼蟲無(wú)論是3齡幼蟲還是5齡幼蟲血淋巴海藻糖的含量也均低于取食對(duì)照水稻“秀水11”的幼蟲血淋巴中海藻糖含量，但差異不顯著。 4 轉(zhuǎn)crylAb基因抗蟲粳稻對(duì)靶標(biāo)害蟲稻縱卷葉螟中腸蛋白酶活性的影響 稻縱卷葉螟3齡幼蟲在取食轉(zhuǎn)cr

7、ylAb基因水稻“KMD1”12h、24h、36h和48h后中腸總蛋白酶活性比對(duì)照有所上升，取食60小時(shí)后的總蛋白酶活性比對(duì)照低；在取食“KMD2”時(shí)，在12h和48h后比對(duì)照略升，而36h和60h后則比對(duì)照下降，取食24h后無(wú)明顯變化。5齡幼蟲在取食轉(zhuǎn)研基因水稻“KMD1”12h、24h、48h和60h后中腸總蛋白酶活性比對(duì)照有所上升，取食36小時(shí)后的總蛋白酶活性和對(duì)照相近：在取食“KMD2”時(shí)，在12h、36h、48h和60h后比對(duì)

8、照略升，而取食24h后比對(duì)照略為下降。 稻縱卷葉螟3齡幼蟲在取食轉(zhuǎn)crylAb基因水稻“KMD1”、“KMD2”分別在12h、24h、36h、48h和60h后中腸強(qiáng)堿性類胰蛋白酶活性比對(duì)照都有所下降，但無(wú)明顯差異。5齡幼蟲除了取食“KMD1”在36h后和取食“KMD2”60h后蛋白酶活性有上升外，其余時(shí)間均表現(xiàn)為下降。 弱堿性類胰蛋白酶活性以及類胰凝乳蛋白酶活性的變化與強(qiáng)堿性類胰蛋白酶活性變化相似，大部分時(shí)間段均呈現(xiàn)下降

9、的趨勢(shì)，除了弱堿性類胰蛋白酶活性在幼蟲3齡取食“KMD1”12h和24h后，5齡取食“KMD2”48h后有所上升，以及類胰凝乳蛋白酶活性在幼蟲3齡取食“KMD1”12h后，5齡取食“KMD2”24h，36h，60h后有所上升。 5 縱卷葉螟絨繭蜂對(duì)轉(zhuǎn)crylAb基因水稻及稻蟲復(fù)合體揮發(fā)物的行為反應(yīng) 在轉(zhuǎn)crylAb水稻“KMD1”和對(duì)照水稻“秀水11”之間，縱卷葉螟絨繭蜂選擇轉(zhuǎn)基因水稻較多，但差異不顯著，在另一轉(zhuǎn)基因水稻

10、“KMD2”上則表現(xiàn)明顯的偏好。在轉(zhuǎn)基因水稻或?qū)φ账竞?齡稻縱卷葉螟幼蟲的復(fù)合體中，縱卷葉螟絨繭蜂極顯著選擇對(duì)照和2齡稻縱卷葉螟幼蟲的復(fù)合體。在轉(zhuǎn)基因水稻或?qū)φ账竞?齡稻縱卷葉螟幼蟲的復(fù)合體中，縱卷葉螟絨繭蜂也是極顯著選擇對(duì)照和4齡稻縱卷葉螟幼蟲的復(fù)合體。 6 轉(zhuǎn)crylAb基因抗蟲粳稻對(duì)縱卷葉螟絨繭蜂生物學(xué)特性的影響 寄生在取食轉(zhuǎn)基因水稻“KMD1”和“KMD2”的稻縱卷葉螟幼蟲體內(nèi)的縱卷葉螟絨繭蜂，其卵+幼蟲歷期

11、與對(duì)照無(wú)明顯差異，2齡寄主育出的雄蜂、雌蜂的壽命都明顯短于對(duì)照，3齡寄主育出的只有雄峰的壽命明顯短于對(duì)照。兩個(gè)齡期寄主育出的絨繭蜂出繭率和羽化率都明顯的低于對(duì)照；繭長(zhǎng)與對(duì)照無(wú)明顯差異；2齡寄主育出的蜂繭重與對(duì)照無(wú)明顯差異，3齡寄主育出的蜂繭重明顯低于對(duì)照；蜂重?zé)o論雌雄都顯著低于對(duì)照；2齡寄主育出的雌雄蜂前翅長(zhǎng)與對(duì)照無(wú)明顯差異，而3齡寄主育出的雌雄蜂前翅長(zhǎng)均顯著低于對(duì)照。 7 Bt毒蛋白在“轉(zhuǎn)Bt基因水稻-稻縱卷葉螟-縱卷葉螟絨繭

12、蜂”食物鏈中的傳遞 ELISA結(jié)果表明，不同生育期“KMD1”和“KMD2”水稻葉鞘內(nèi)均含有CrylAb殺蟲蛋白，“KMD1”和“KMD2”在不同生育期間存在差異，其中苗期、分蘗期和孕穗期葉鞘內(nèi)CrylAb殺蟲蛋白的含量顯著高于黃熟期?！癒MD1”和“KMD2”上取食的稻縱卷葉螟幼蟲整體中則可以檢測(cè)到毒蛋白的存在。在取食“KMD1”的連續(xù)5天內(nèi)，其體內(nèi)的CrylAb殺蟲蛋白含量表現(xiàn)出先下降再略上升的趨勢(shì)。而在“KMD2”上，第3

13、天的變化趨勢(shì)和“KMDl”相反，其他基本一致，但均無(wú)顯著差異。同時(shí)，在縱卷葉螟絨繭蜂幼蜂體內(nèi)也檢測(cè)到了CrylAb殺蟲蛋白的存在。并且隨著稻縱卷葉螟取食Bt水稻時(shí)間的延長(zhǎng)，體內(nèi)的毒蛋白有逐漸下降的趨勢(shì)。單頭縱卷葉螟絨繭蜂中毒蛋白的含量明顯低于單頭稻縱卷葉螟幼蟲體內(nèi)的含量。同時(shí)，我們也檢測(cè)了解剖的稻縱卷葉螟幼蟲的血淋巴、稻縱卷葉螟幼蟲整體以及稻縱卷葉螟幼蟲排泄物中殺蟲蛋白的含量。隨著取食時(shí)間的延長(zhǎng)，稻縱卷葉螟幼蟲的血淋巴、稻縱卷葉螟幼蟲以

14、及稻縱卷葉螟幼蟲排泄物中殺蟲蛋白的含量沒(méi)有上升的趨勢(shì)，反而有一定的下降。 8 轉(zhuǎn)Bt基因水稻對(duì)稻田生境內(nèi)節(jié)肢動(dòng)物群落多樣性的影響 在3年3地點(diǎn)的調(diào)查中，Bt稻田和對(duì)照田間節(jié)肢動(dòng)物物種總數(shù)沒(méi)有明顯差異，在杭州試驗(yàn)田中，Bt水稻(B系列)上節(jié)肢動(dòng)物的物種總數(shù)略少于對(duì)照田塊，但差異不顯著：在建德試驗(yàn)田中，Bt水稻(TT系列)上節(jié)肢動(dòng)物物種總數(shù)略高于對(duì)照田塊，差異也不顯著；富陽(yáng)試驗(yàn)田塊中Bt水稻(K系列)上節(jié)肢動(dòng)物物種總數(shù)與對(duì)照