潰結(jié)靈對潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠Toll樣受體及NF-κB的作用.pdf

1、免疫因素尤其是細胞因子在IBD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，對這些細胞因子的研究使UC的發(fā)病及治療研究有了一定的進展，治療上取得了一定的效果，但尚未能認識UC發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。隨著對細胞因子、粘附分子的研究，尤其近年對核因子-κB(NF-κB)及Toll樣受體(TLRs)的研究，正逐步揭示著IBD的發(fā)病機制，TLRs/NF-κB通路的部分闡明也為尋找IBD的治療提供了新的契機，通過抑制此通路的關(guān)鍵分子進而阻斷IBD過激的炎癥反應(yīng)已成為眾多學(xué)者研

2、究的方向。中醫(yī)藥在UC的治療上有較好的療效，很多達到與西藥相近的治療效果，且可彌補西藥較大毒副作用及停藥后易復(fù)發(fā)的不足，有著廣闊的應(yīng)用和開發(fā)前景。中醫(yī)藥治療IBD的實驗研究尤其是作用機理的研究是目前中醫(yī)藥治療IBD尤其是UC的重點，在這方面的研究取得進展，將會揭示中藥作用的較確切的作用靶點。本研究對治療UC療效確切的中藥復(fù)方潰結(jié)靈進行深入的作用機理研究，在前期臨床、實驗研究基礎(chǔ)上更進一步從細胞因子表達的源頭TLRs/NF-κB通路入手，

3、觀察潰結(jié)靈對此通路的一些關(guān)鍵環(huán)節(jié)TLR2、TLR4表達和NF-κB活化的干預(yù)作用，這一研究將使中醫(yī)藥治療UC的機理研究深入到基因調(diào)控水平，并為高質(zhì)量的抗UC中藥新藥的開發(fā)打下堅實的基礎(chǔ)。 1潰結(jié)靈對UC大鼠治療作用的病理觀察 我們研究所在多年臨床經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，以清熱健脾活血為治則，總結(jié)出治療潰瘍性結(jié)腸炎的中藥復(fù)方潰結(jié)靈，臨床取得了較好的療效，無明顯毒副作用。為驗證其臨床療效，并進一步探討其作用機理，我們采用三硝基苯磺酸法

4、制作潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型，并在此模型上觀察了潰結(jié)靈的治療效果，潰結(jié)靈采用三個劑量給藥治療，陽性組用SASP治療，并設(shè)陰性(模型空白)及正常對照組。治療結(jié)束進行病理觀察，大體觀察計數(shù)潰瘍個數(shù)、測量潰瘍總面積、并計算組織損傷積分，光鏡下觀察腸粘膜組織炎癥、水腫和充血程度(分級法)。結(jié)果表明，模型組腸粘膜出現(xiàn)大小不等的潰瘍，光鏡下顯示炎癥和水腫程度較重；大體觀察潰結(jié)靈高、中劑量組潰瘍個數(shù)、潰瘍面積、組織損傷積分均明顯少于模型組(P＜0.05或

5、P＜0.01)；光鏡下觀察潰結(jié)靈高、中劑量組腸粘膜炎癥程度明顯輕于模型組(P＜0.05或P＜0.01)；潰結(jié)靈高劑量組腸粘膜充血和水腫程度較模型組明顯減輕(P＜0.05)。潰結(jié)靈能明顯減少模型大鼠結(jié)腸潰瘍個數(shù)和面積，改善結(jié)腸粘膜炎癥和水腫等病理變化，提示潰結(jié)靈對三硝基苯磺酸潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型有較好的治療作用，驗證了臨床治療效果。 2潰結(jié)靈對UC大鼠血清中促炎因子IL-1β、TNF-α的作用 細胞因子在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病

6、及進展中起到了重要的作用，尤其是促炎因子，其中IL-1β和TNF-α最具代表性。我們在潰結(jié)靈抗實驗性UC作用的基礎(chǔ)上，觀察了該藥對IL-1β、TNF-α的作用，不僅是對該藥療效的進一步驗證，也是對其作用機制的探討。采用三個劑量對TBNS法UC大鼠模型進行治療，治療結(jié)束采血并制備血清樣本，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測血清樣本中IL-1β、TNF-α的含量。結(jié)果表明，潰結(jié)靈高、中劑量組血清樣本中TNF-α、IL-1β的含量明顯小于

7、模型組血清樣本(P＜0.01)。提示潰結(jié)靈能夠降低模型大鼠血中對UC發(fā)病及進展起重要作用的促炎因子IL-1β、TNF-α的含量。 3潰結(jié)靈對UC大鼠血清中抑炎因子IL-4的作用 在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病的免疫學(xué)機制中，促炎因子和抑炎因子的失衡是潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生發(fā)展的重要因素。為探討潰結(jié)靈治療UC的作用機理，我們在潰結(jié)靈抗實驗性UC作用的基礎(chǔ)上，觀察了該藥對抑炎因子IL-4的作用。采用三個劑量對TBNS法UC大鼠模型進行治療，治

8、療結(jié)束采血并制備血清樣本，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測血清樣本中IL-4的含量，并進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果表明，模型組血清樣本中IL-4的含量明顯高于正常對照組(P＜0.01)；潰結(jié)靈高劑量組IL-4含量明顯小于模型組(P＜0.01)。IL-4在潰瘍性結(jié)腸炎患者和實驗動物模型中的含量變化目前存在較大爭議，甚至有相對立的結(jié)果出現(xiàn)，本實驗潰結(jié)靈降低IL-4的含量在其抗UC療效中的作用尚有待進一步研究。 4潰結(jié)靈對UC大鼠結(jié)腸粘

9、膜NF-κBP65蛋白表達的作用 近年對核因子-κB(NF-κB)及Toll樣受體(TLRs)/NF-κB通路的研究，正逐步揭示著IBD的發(fā)病機制，成為當(dāng)前潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病及治療研究的熱點。我們在前面研究工作的基礎(chǔ)上，對結(jié)腸粘膜NF-κBP65蛋白表達進行檢測，以期對潰結(jié)靈治療UC的較深層次的作用機理進行探討。采用三個劑量對TBNS法UC大鼠模型進行治療，治療結(jié)束后取結(jié)腸組織固定，切片進行免疫組化染色，光鏡下計數(shù)陽性細胞百分率，

10、并進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果表明，模型組結(jié)腸粘膜P65蛋白陽性細胞表達率明顯高于正常對照組(P＜0.01)；潰結(jié)靈高、中劑量組結(jié)腸粘膜P65蛋白陽性細胞表達率明顯低于模型組(P＜0.01)。提示潰結(jié)靈能明顯降低UC大鼠模型結(jié)腸粘膜NF-κP65蛋白陽性細胞率。 5潰結(jié)靈對UC大鼠結(jié)腸粘膜Toll樣受體2、4基因表達的作用 Toll樣受體(TLRs)是NF-κB激活的TLRs/NF-κB通路的重要環(huán)節(jié)。通過對TOLL樣受體表達的

11、抑制，可以抑制TLRs/NF-κB通路的活化，從而對潰瘍性結(jié)腸炎起到治療作用，因此我們觀察了潰結(jié)靈對TBNS法UC大鼠模型結(jié)腸組織中TLR2、TLR4表達的作用，以期對潰結(jié)靈治療UC的作用機制進行較深入的探討。采用三個劑量對TBNS法UC大鼠模型進行治療，治療結(jié)束后采集結(jié)腸粘膜標(biāo)本。用Trizol提取總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，以β-actin作為內(nèi)參進行PCR反應(yīng)，產(chǎn)物進行凝膠電泳分離，經(jīng)染色后進行灰度分析，以TLR2、TLR4的灰度值與

12、β-actin灰度值的比值作為相對表達量，進行組間比較分析。結(jié)果表明，模型組TLR2、TLR4基因相對表達量明顯高于正常組(P＜0.01)；潰結(jié)靈中、高劑量組TLR2相對表達量明顯低于模型組(P＜0.05)；潰結(jié)靈高劑量組TLR4相對表達量明顯低于模型組(P＜0.05)。潰結(jié)靈對TNBS法UC大鼠模型結(jié)腸粘膜TLR2、TLR4基因表達有抑制作用。 TLRs/NF-κB通路在IBD的發(fā)生發(fā)展中占舉足輕重的地位，NF-κB對很多UC

13、發(fā)病的關(guān)鍵性細胞因子有調(diào)控作用，從而參與了UC腸道的炎癥和免疫反應(yīng)。當(dāng)上游刺激因子與TLRs結(jié)合，TLRs向細胞內(nèi)傳遞活化信號，激活NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子，進而調(diào)節(jié)炎癥遞質(zhì)的產(chǎn)量，導(dǎo)致IBD炎癥粘膜的損傷。NF-κB活化后會產(chǎn)生持續(xù)擴大的炎癥反應(yīng)，使病情不斷進展，這時即使初始病因得以去除，炎癥反應(yīng)也不會立即終止。對TLRs/NF-κB通路中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)NF-κB、TLRs及其上(下)游分子如TNF-α、IL-1β等進行干預(yù)，可以有效地阻止U