肝纖維化相關細胞因子shRNA表達載體的構建及在肝星狀細胞中的表達.pdf

1、目的:結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)是新近發(fā)現(xiàn)的一種促肝纖維化的重要細胞因子,是轉化生長因子β(transforminggrowth factorβ,TGF-β)信號傳導途徑的下游效應介質。CTGF可直接介導原代肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)活化、增殖及遷移,還能促進活化HSC的合成及分泌細胞外基質(extracellular matrix,

2、ECM)。金屬蛋白酶組織抑制因子1(tissue inhibitor of metalloproteinase1,TIMP-1)也是TGF-β信號傳導途徑的下游效應介質,在肝纖維化發(fā)生時,它主要由激活的HSC表達。TIMP-1不僅抑制基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)活性阻止膠原降解,也通過抑制HSC凋亡、促進膠原分泌而在肝纖維化病情進展中發(fā)揮關鍵作用。所以,減少CTGF和TIMP-1的表達,可

3、以減輕肝纖維化程度。本研究旨在構建以大鼠CTGF或TIMP-1基因為靶點的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)表達載體,為進一步探索肝纖維化的基因治療提供有力工具。方法:根據前期篩選出的對CTGF和TIMP-1基因最有效的RNA干擾靶位,即CTGF基因1560～1580nt和TIMP-1基因412～432nt,按照RNA干擾(RNA interference,RNAi)序列設計原則,各設計1對含有短發(fā)夾結構的R

4、NAi靶點序列,退火形成雙鏈DNA,分別克隆到經雙酶切后的質粒載體psiRNA-DUO-GFPzeo,構建成含目的靶基因片段的重組質粒載體psiRNA-GFP-CTGF、psiRNA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com(含有CTGF和TIMP-1),并對重組質粒進行雙酶切瓊脂糖電泳和測序鑒定。體外復蘇培養(yǎng)大鼠的肝星狀細胞,取對數生長期細胞0.25％胰蛋白酶消化,3×105/ml接種于六孔板中,待細胞長到80％左右融合時,

5、無血清Opti-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)同步化,利用脂質體(TransFast Transfmlection Reagent)2000介導,將構建成功的重組質粒(psiRNA-GFP-CTGF、psiRNA-GFP-TIMP-1和psiRNA-GFP-Com(含有 CTGF和 TIMP-1)及空載體psiRNA—DUO-GFPzeo瞬時轉染大鼠的肝星狀細胞,熒光顯微鏡觀察質粒轉染情況,用流式細胞儀測轉染的效率。結果:1、證實以大鼠CTGF或TI

6、MP-1基因為靶點的表達 shRNA.的目的基因片段分別被成功的克隆到質粒載體psiRNA—DUO-GFPzeo中,測序結果證明重組質粒載體的插入序列與設計的靶基因片段完全一致。2:用瞬時轉染肝星狀細胞后熒光顯微鏡觀察,在轉染進質粒的細胞全部發(fā)綠色熒光,初步證實能轉染進肝星狀細胞。結論:成功構建靶向大鼠CTGF和TIMP-1最有效的RNA干擾靶位的shRNA表達質粒重組體。瞬時轉染到轉染大鼠的肝星狀細胞,在熒光顯微鏡能發(fā)現(xiàn)帶有熒光的細胞