延邊黃牛成纖維細胞培養(yǎng)、冷凍保存及核移植效率的研究.pdf

1、本試驗以延邊黃牛耳皮膚成纖維細胞保存為基礎，利用組織塊培養(yǎng)法，首次建立了延邊黃牛耳皮膚成纖維細胞系，并對成纖維細胞進行液氮冷凍保存，得到延邊黃牛耳皮膚成纖維細胞最佳保存體系。通過從屠宰場收集卵巢，回收卵丘卵母細胞復合體(COCs)，以成熟培養(yǎng)后的去核卵母細胞作為核受體，以成纖維細胞作核供體進行核移植，研究了延邊黃牛成纖維細胞的生物學特性、冷凍保存效果及克隆技術的應用。結果表明： 1.通過組織塊培養(yǎng)法，獲得了傳代培養(yǎng)的延邊黃牛耳皮

2、膚成纖維細胞，延邊黃牛皮膚成纖維細胞在體外培養(yǎng)時呈貼壁生長，原代與早期傳代細胞是上皮細胞與成纖維細胞的混合物。 2.混合生長的傳代細胞用0.25％胰蛋白酶與0.02％EDTA液于37℃下消化處理2～3min，脫壁懸浮的主要為成纖維細胞，在傳代過程中采用反復消化法將二者分離純化，獲得可正常傳代的延邊黃牛耳皮膚成纖維細胞，表明采用反復消化法可以得到純化的成纖維細胞系。 3.通過繪制生長曲線研究了延邊黃牛耳皮膚成纖維細胞的增殖

3、規(guī)律，用DMEM培養(yǎng)延邊黃牛耳皮膚成纖維細胞，傳代后滯留期較短，約有一天左右，活細胞逐漸貼壁生長。此后進入對數(shù)生長期，延續(xù)六天左右。第八天細胞發(fā)生接觸抑制而開始死亡，細胞數(shù)量進入平臺期，維持三天左右，細胞逐漸脫落死亡，細胞數(shù)量有所下降。 4.染色體檢測表明，延邊黃牛耳皮膚成纖維細胞在適宜的培養(yǎng)體系，至少可以傳至15代并保持染色體倍性正常。 5.在以延邊黃牛耳皮膚成纖維細胞不同甘油濃度與不同血清濃度情況下進行冷凍試驗中，得

4、到最適合實驗操作的甘油濃度為1096，血清的濃度為20％，復蘇率可達到96％。 6.在以不同密度與不同冷凍保護劑進行冷凍試驗中，得到適合延邊黃牛成纖維細胞冷凍保存的密度為2×10<'6>cells/mL，冷凍劑為甘油，復蘇率可達到98％。 7.冷凍保存的延邊黃牛成纖維細胞復蘇時，分別以20℃及37℃不同溫度解凍，結果表明：37℃條件下進行解凍復蘇率優(yōu)于20℃(p<0.05)。 8.本實驗采用延邊黃牛卵丘細胞、輸卵

5、管上皮細胞及耳皮肽成纖維細胞分別進行核移植，所得結果顯示發(fā)育率差異不顯著，但三種細胞所得胚胎分裂率差異顯著(P<0.05)，其中卵丘細胞效果最好。 9.分別使用第5～7代與11～13代延邊黃牛耳皮膚成纖維細胞進行供核操作時，5～7代所得的卵裂率比11～13代的高(P<0.05)，但發(fā)育率結果顯示11～13代比5～7代的高(P>0.05)。 10.未冷凍保存與冷凍保存的延邊黃牛耳皮膚成纖維細胞用做體細胞克隆供核細胞時，結果