bcr-abl融合基因特異性多重siRNAs真核表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、研究背景：
　　 慢性髓細(xì)胞性白血?。╟hronic myeloid leukemia，CML）是一種造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，其發(fā)病機(jī)制為染色體易位t（9；22）（q34；q11），由于bcr基因斷裂點(diǎn)的不同，產(chǎn)生不同的bcr/abl融合基因，CML最主要的是b3a2這一型融合（95％以上），其表達(dá)的P210BCR/ABL融合蛋白具有異常增強(qiáng)的酪氨酸蛋白激酶（protein tyrosinekinase，PTK）活性，通過(guò)改

2、變?cè)煅?xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)傳導(dǎo)途徑，調(diào)控細(xì)胞的粘附、增殖和凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞惡性擴(kuò)增而致病。因此探索有效抑制bcr/abl融合基因，下調(diào)P210BCR/ABL的形成，或拮抗P210BCR/ABL的PTK活性以及阻斷P210BCR/ABL介導(dǎo)的傳導(dǎo)通路等已成為治療的新策略。人工合成的P210BCR/ABLPTK抑制劑（TKI）甲磺酸伊馬替尼（ST1571,商品名格列衛(wèi)），可特異性阻斷P210BCR/ABL的酪氨酸激酶活性，在CML臨床應(yīng)用中已取得

3、良好療效，使CML的治療進(jìn)入一個(gè)新的時(shí)代。然而，有部分病人出現(xiàn)不能耐受的毒副作用，還有部分病人逐漸出現(xiàn)耐藥，耐藥的主要原因?yàn)閎cr/abl基因上的點(diǎn)突變、bcr/abl基因過(guò)度擴(kuò)增和表達(dá)，雖然目前第二代的酪氨酸激酶抑制劑尼洛替尼、達(dá)沙替尼能解決大部分耐藥問(wèn)題，但難免也會(huì)逐漸出現(xiàn)耐藥，而且這種TKI的作用靶點(diǎn)是bcr/abl融合基因下游的融合蛋白，并不能真正解決bcr/abl融合基因之病根，理論上說(shuō)不能治愈CML，因此針對(duì)bcr/abl融

4、合基因作為理想分子靶點(diǎn)的基因治療也是研究的熱點(diǎn)之一。
　　 RNA干擾（RNA interference，RNAi）是最近十幾年發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新興的在轉(zhuǎn)錄后水平的基因阻斷技術(shù)，與以往的基因阻斷技術(shù)比較，如基因敲除、反義寡核苷酸技術(shù)等，RNAi更具有快速、有效和序列特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。已有研究證明，針對(duì)bcr/abl mRNA融合位點(diǎn)設(shè)計(jì)的siRNA能夠顯著下調(diào)K562細(xì)胞中bcr/abl基因表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但是這種

5、體外化學(xué)合成的siRNA很容易降解，不穩(wěn)定，產(chǎn)生的RNAi效應(yīng)短暫。篩選高效siRNA和使之持久穩(wěn)定的表達(dá)，利用真核表達(dá)載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)合成表達(dá)有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的siRNA，是體外合成siRNA有效的替代方案，這種方案更接近生物體產(chǎn)生RNAi現(xiàn)象的自然機(jī)制并有可能用于基因治療。本實(shí)驗(yàn)利用本課題組先前構(gòu)建好的一系列可包含1～6個(gè)siRNA表達(dá)單位的表達(dá)型載體，首先設(shè)計(jì)構(gòu)建針對(duì)bcr/abl融合基因的單一siRNA真核細(xì)胞表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染K56

6、2細(xì)胞株，檢測(cè)細(xì)胞株bcr/abl mRNA及BCR/ABL融合蛋白的表達(dá)水平，證實(shí)該表達(dá)載體能在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生作用，并對(duì)bcr/abl基因有干擾效應(yīng)；然后在此研究基礎(chǔ)上，我們?cè)O(shè)計(jì)構(gòu)建針對(duì)bcr/abl融合基因的多重siRNAs表達(dá)型載體，來(lái)放大和強(qiáng)化這種siRNA的RNAi效應(yīng)，為進(jìn)一步探索CML的基因治療提供一種新的手段。
　　 目的：構(gòu)建針對(duì)bcr/abl融合基因的多重siRNAs真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步探索siRNA的體內(nèi)研究

7、及CML基因治療的新策略，提供一種技術(shù)手段。
　　 方法：
　　 第一部分：bcr/abl融合基因單個(gè)siRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
　　 1.K562白血病細(xì)胞株在加有10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，5％CO2條件下37℃培養(yǎng)。
　　 2.根據(jù)文獻(xiàn)已證實(shí)有效的、針對(duì)bcr/abl基因特異性siRNA序列，將模板序列克隆至p1-siRNA質(zhì)粒中，并酶切、測(cè)序鑒定。
　　 3.用脂質(zhì)體L

8、ipofectamineTM LTX將測(cè)序正確的重組子轉(zhuǎn)染至K562細(xì)胞株中，利用RT－PCR、Western Blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞株中bcr/abl mRNA和BCR/ABL融合蛋白的表達(dá)水平，以及通過(guò)MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖情況和使用Annexin V聯(lián)合PI法流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，這樣不僅再次驗(yàn)證所選siRNA序列的有效性，同時(shí)也證明我們所選用的這一siRNA真核表達(dá)載體系統(tǒng)的有效性。
　　 第二部分：bcr

9、/abl融合基因的多重siRNAs真核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 在上述證實(shí)siRNA序列和siRNA表達(dá)載體系統(tǒng)有效的基礎(chǔ)上，重復(fù)性將相同的和不同的siRNA接入含多個(gè)siRNA表達(dá)單位的載體p6-siRNA中，構(gòu)建針對(duì)bcr/abl基因的多重siRNAs真核表達(dá)型載體。
　　 結(jié)果：
　　 1.經(jīng)酶切、測(cè)序驗(yàn)證，bcr/abl融合基因的siRNA真核表達(dá)載體的模板序列與設(shè)計(jì)序列完全正確，成功構(gòu)建p1-siRNA1、

10、p1-siRNA2和p1-siRNAn質(zhì)粒。
　　 2.通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體LipofectamineTM LTX將p1-siRNA1和p1-siRNA2、p1-siRNAn質(zhì)粒以及GFP陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到K562細(xì)胞株中，經(jīng)熒光顯微鏡觀察綠色熒光，估計(jì)轉(zhuǎn)染效率：約30％。
　　 3.轉(zhuǎn)染特異性質(zhì)粒p1-siRNA1和非特異性質(zhì)粒p1-siRNAn的K562細(xì)胞株比較：bcr/abl mRNA水平降低了27.6％，BCR

11、/ABL蛋白表達(dá)水平下降了30.6％；再比較相應(yīng)的細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率，分別為40.1％ vs 16.5％和9.65％ vs 1.79％。同樣，簡(jiǎn)單地比較了轉(zhuǎn)染特異性質(zhì)粒p1-siRNA2和非特異性質(zhì)粒p1-siRNAn的K562細(xì)胞株的bcr/abl mRNA水平降低了28.7％。
　　 由以上結(jié)果證明所選擇的兩個(gè)siRNA序列和siRNA真核表達(dá)載體系統(tǒng)確實(shí)有效，因此可以繼續(xù)構(gòu)建bcr/abl融合基因的多重siRNA真

12、核表達(dá)載體。
　　 4.經(jīng)酶切、測(cè)序驗(yàn)證，bcr/abl融合基因的多重siRNA真核表達(dá)載體的模板序列與設(shè)計(jì)序列完全正確，成功構(gòu)建針對(duì)bcr/abl融合基因的多重siRNAs真核表達(dá)載體。
　　 結(jié)論：
　　 1.我們所構(gòu)建的針對(duì)bcr/abl融合基因siRNA真核表達(dá)載體p1-siRNA1質(zhì)粒通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體LipofectamineTM LTX轉(zhuǎn)染到K562細(xì)胞株中，經(jīng)RT－PCR和Western Blot