大腸桿菌外膜蛋白F的表達與鑒定.pdf

1、在醫(yī)藥領(lǐng)域,抗菌藥物的發(fā)現(xiàn)與使用是20世紀人類最偉大的成就之一,其后隨著研究者們對抗菌藥物的深入研究以及各種化學(xué)合成技術(shù)的發(fā)展,抗菌藥物的種類也得到的快速的增加和變得多樣化。如果說人類利用各種結(jié)構(gòu)的抗菌藥物對不同或相同種屬的感染細菌進行殺滅或抑制作用是人類對感染病菌的第一次征服的話,那么由于抗生素的不合理使用而導(dǎo)致的細菌耐藥性的事實將是人類目前所需面臨得對病原菌的第二次征服之戰(zhàn)。為了獲得第二次“戰(zhàn)爭”的勝利,必須首先清楚地了解細菌對各種

2、抗菌藥物的耐藥機制,針對各種耐藥機制尋找新的藥物作用靶標并研制開發(fā)出療效更好的藥物。在了解了細菌對抗生素的各種耐藥機制后發(fā)現(xiàn),幾乎都有蛋白質(zhì)的參與,如外排泵系統(tǒng)、細胞膜滲透性的變化、核糖體保護蛋白、藥物滅活酶等,可見蛋白質(zhì)在細菌的耐藥中有著舉足輕重的作用。目前研究最多的蛋白質(zhì)是與細菌外膜滲透性變化相關(guān)的蛋白質(zhì)。外膜結(jié)構(gòu)是革蘭陰性細菌所特有的結(jié)構(gòu),因此與革蘭陽性菌相比,在其他耐藥機制相似的前提下,還有外膜的屏障作用,使得革蘭陰性菌比陽性菌

3、更易耐受藥物的作用。因此,對革蘭陰性細菌外膜蛋白(outer membrane protein,Omp)的研究也最多。大腸埃希氏菌作為臨床常見的條件致病菌,也是典型的革蘭陰性細菌,與其耐藥機制中相關(guān)的外膜蛋白有OmpC,OmpF,PhoE,LamB和蛋白K。本實驗選擇大腸桿菌的外膜蛋白中的一種-外膜蛋白F(OmpF)進行進一步研究,以期為后續(xù)與之同源或結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)在細菌耐藥方面的研究奠定實驗基礎(chǔ)。
　　 本研究首先利用NCB

4、I數(shù)據(jù)庫和Premier Primer5.0軟件設(shè)計出合適的PCR引物,通過PCR技術(shù),以大腸桿菌基因組DNA為模板,擴增大腸桿菌外膜蛋白F基因序列,用NcoI和XhoI對目的基因片段進行雙酶切,經(jīng)過純化處理后的酶切產(chǎn)物,與pET-28c(+)載體進行連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入克隆型大腸桿菌宿主細胞Top10,通過抗性篩選和酶切鑒定的方法篩選出陽性克隆。重組質(zhì)粒的原核表達與鑒定將測序J下確的克隆轉(zhuǎn)化入表達型大腸桿菌宿主細胞BL21(DE3),

5、利用IPTG誘導(dǎo)目的蛋白的表達,取不同時間的培養(yǎng)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析,確定出最優(yōu)表達溫度,再在此條件下大量表達目的蛋白,并利用金屬離子親和層析技術(shù),由帶有六聚組氨酸標簽的融合蛋白與重金屬鎳離子特異性非共價結(jié)合而純化出目的蛋白,同時對純化后的目的蛋白進行質(zhì)譜檢測。成功構(gòu)建了原核重組質(zhì)粒pET-OmpF。經(jīng)過測序表明,OmpF基因片段全長1089bp。SDS-PAGE結(jié)果發(fā)現(xiàn),當大腸桿菌的誘導(dǎo)溫度為25℃時,目的蛋白的表達率最高。利

6、用金屬離子親和層析技術(shù)可純化出符合質(zhì)譜檢測純度要求的蛋白質(zhì),利用MALDI-TOF質(zhì)譜對目的蛋白進行檢測。本實驗利用pET系列載體-pET-28c(+)載體通過分子生物學(xué)的方法,將目的蛋白基因插入其中,轉(zhuǎn)入宿主細胞后成功構(gòu)建并表達出了大腸桿菌外膜蛋白F,同時鎳離子親和層析柱對含有組氨酸標簽的融合蛋白進行特異性地吸附分離純化作用,為后續(xù)質(zhì)譜的檢測提供了純度較高的蛋白樣品。通過MALDI-TOF質(zhì)譜檢測,確定出OmpF的一級結(jié)構(gòu),為后續(xù)與之