水霉拮抗菌株的篩選與作用效果研究.pdf

1、水霉病為淡水養(yǎng)殖的常見病害，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。孔雀石綠在全球范圍內(nèi)的禁用，更加劇了水霉病的危害。然而抗生素類藥物在水產(chǎn)上易引起耐藥菌株的產(chǎn)生、藥物殘留等問題。生態(tài)防治是一個行之有效的途徑，能夠控制病原菌的數(shù)量，減少疾病的發(fā)生，同時還能改善養(yǎng)殖環(huán)境，維護微生態(tài)平衡。本著為水霉病生態(tài)防治益生菌開發(fā)提供候選菌株的目的，對水霉拮抗菌株進行了篩選，并對其益生效果進行了評價。 為了獲得篩選用指示菌株——水霉病致病菌株，從感染

2、水霉病的史氏鱘肌肉組織分離獲得一株水霉菌株XJ001，其游動孢子釋放方式為水霉屬方式，通過電鏡觀察第二孢孢子，表面有長的帶鉤的毛紋飾，且第二孢孢子呈現(xiàn)間接萌發(fā)方式，XJ001不能產(chǎn)生有性結構。根據(jù)這些形態(tài)特征可將XJ001鑒定為寄生水霉(Saprolegnia parasitica)；采用人工攻毒感染異育銀鯽實驗表明，異育銀鯽感染后出現(xiàn)了水霉典型白毛癥狀，死亡率高達83.3％，因此可以判定為水霉病的致病菌株。同時人工感染異育銀鯽水霉病方

3、法為研究拮抗菌對水霉病的防治效果提供了技術保障。 為了獲得水霉病病原的拮抗微生物，以水霉XJ001為指示病原菌，對其拮抗菌進行了篩選。結果表明，從不同地區(qū)的養(yǎng)殖環(huán)境中共分離得到了213株細菌，其中對水霉表現(xiàn)出抑制作用的有103株，能完全抑制水霉生長的有11株。通過測定菌株溶血素的產(chǎn)生、培養(yǎng)1、2天后對水霉菌絲生長抑制作用、菌體對水霉孢子萌發(fā)生長抑制作用、無細胞發(fā)酵濾液拮抗活性，對11株拮抗菌株進行了復篩，K1、M3在各方面的拮抗

4、活性最為突出，且無溶血素產(chǎn)生。 選擇M3菌株，研究了菌體、無細胞發(fā)酵液的體外拮抗活性，并對M3無細胞發(fā)酵液的拮抗活性產(chǎn)生原因進行了分析，研究了M3產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)的穩(wěn)定性。結果顯示，平板抑制實驗中，M3能夠顯著抑制水霉菌絲生長及孢子萌發(fā)。M3菌落周圍形成清晰的抑菌圈，且抑制作用大小與M3培養(yǎng)時間有關，培養(yǎng)2d后產(chǎn)生的抑菌圈直徑為30mm，培養(yǎng)3d后的抑菌圈直徑為50mm，而陽性對照中，真菌藥敏紙片咪康唑(10μg/片)對水霉形成的

5、抑菌圈直徑為14ram，1000ppm孔雀石綠形成的抑菌圈直徑為40mm。距離為30mm的M3菌線間，孢子的萌發(fā)完全受到抑制。M3無細胞發(fā)酵液實驗表明，瓊脂擴散法實驗中，M3無細胞發(fā)酵液對水霉菌絲生長沒有抑制作用；24孔板法實驗中，與對照組相比，M3無細胞發(fā)酵液能夠顯著抑制水霉菌絲生長及孢子萌發(fā)。M3無細胞發(fā)酵液原液及2倍無菌水稀釋液能夠完全抑制水霉菌絲生長及孢子萌發(fā)，與對照相比，5倍、10倍稀釋無菌發(fā)酵液顯著延緩了水霉菌絲的生長，當對

6、照組中的菌絲鋪滿整個孔徑時，5倍、10倍稀釋無細胞發(fā)酵液組中水霉的菌絲長度分別為2.3mm和7.6mm；對孢子而言，與對照組中86.3％的孢子萌發(fā)率相比，5倍、10倍稀釋無細胞發(fā)酵液組中的孢子萌發(fā)率分別為18.2％和44％，且萌發(fā)后的菌絲生長也受到抑制，5倍稀釋組中萌發(fā)后的菌絲在整個實驗過程中均未形成網(wǎng)狀，10倍稀釋組中的萌發(fā)后的菌絲在實驗最后階段形成網(wǎng)狀，而對照組中萌發(fā)形成的菌絲則在實驗后的20h時就呈現(xiàn)網(wǎng)狀了。水霉在pH為5～9的B

7、HI液體培養(yǎng)基中均能生長，而M3無細胞發(fā)酵液的pH值為8.23，且用BHI液體培養(yǎng)基稀釋2倍后的M3無細胞發(fā)酵液同樣能完全抑制水霉菌絲生長，結果表明M3產(chǎn)生拮抗作用不是因為pH值的改變及營養(yǎng)競爭，而是產(chǎn)生了具有拮抗活性的物質(zhì)。采用二氯甲烷、乙醚兩種有機溶劑不能從M3無細胞發(fā)酵液中提取出有拮抗活性的物質(zhì)；采用硫酸銨沉淀法也不能使拮抗活性物質(zhì)從M3無細胞發(fā)酵液中有效分離出來。Fe2+對M3產(chǎn)生拮抗物質(zhì)量有一定的影響，當培養(yǎng)基中的Fe2+濃度

8、低于50μmol/L時，其5倍無菌水稀釋液能完全抑制水霉菌絲生長：而當Fe2+濃度為100μm/L時，與0、5μmol/L Fe2+濃度組相比，5倍無菌水稀釋液對菌絲生長抑制率下降了8.3％，而10倍稀釋組抑制率則分別下降了35.5％、37.7％。同時研究了M3產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)的穩(wěn)定性，結果表明，M3無細胞發(fā)酵液對溫度不敏感；對pH較不敏感；對蛋白酶K敏感，蛋白酶作用后對其拮抗活性有影響。以此可以推斷，M3無細胞發(fā)酵液中拮抗活性成份為蛋白

9、性質(zhì)的。M3無細胞發(fā)酵液經(jīng)過截留分子量為3KD的超濾管超濾后濾液的拮抗活性沒有改變，可以推出其拮抗活性物質(zhì)的分子量低于3KD。 為了評價M3菌株的應用效果，及為將M3作為益生菌開發(fā)的候選菌株提供理論參考依據(jù)，研究了M3對人工感染異育銀鯽水霉病的防治效果。結果表明，預防實驗中，M3能夠有效預防水霉病的發(fā)生，降低了異育銀鯽的死亡率，M3實驗組中異育銀鯽水霉病的感染死亡率為53.3％，而對照組中異育銀鯽的感染死亡率為86.7％；治療實

10、驗中，對照組中的異育銀鯽在實驗后第3d，死亡率就達到90％，第4d時死亡率達到100％，而M3處理組在實驗的前3d內(nèi)，異育銀鯽的死亡率僅為3.3％，隨著時間的推遲，死亡率逐漸增大，至實驗結束時死亡率達到了90％。 采用ATB細菌自動鑒定系統(tǒng)鑒定M3為嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)，為了進一步確定M3的分類學地位，測定了其16S rRNA基因序列，分析了相關細菌相應序列的同源性，構建了系統(tǒng)發(fā)生樹，結果表明M

11、3與Aeromonas hydrophila (DQ095911)親緣關系最近，因此將M3鑒定為嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)。研究了其對異育銀鯽、中華絨鰲蟹的急性毒性，結果表明，M3菌株對異育銀鯽、中華絨鰲蟹沒有致病性，是安全的。為了在規(guī)?；a(chǎn)中提高M3的培養(yǎng)效率，對M3的培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化研究，測定了不同溫度、pH、碳源、氮源、無機鹽對M3生長的影響，并采用正交試驗對培養(yǎng)基組份配比優(yōu)化，結果表明，M3生長