大白菜硫甙合成基因特異SSR標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用.pdf

1、硫代葡萄糖甙(簡(jiǎn)稱硫甙，Glucosinolate)是十字花科重要的一種次生代謝產(chǎn)物，是白菜類作物（Brassica campetris syn.rapa，2n=20）中的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)成分。但是，直接測(cè)定硫甙含量費(fèi)時(shí)費(fèi)力，在育種過(guò)程中不宜直接選擇。有必要在分子水平上對(duì)硫甙含量和不同組分的變異特點(diǎn)進(jìn)行研究，從而能夠進(jìn)一步發(fā)掘優(yōu)異基因資源。
　　本研究根據(jù)大白菜基因組序列信息，針對(duì)大白菜硫甙合成相關(guān)的所有基因開發(fā)特異SSR位點(diǎn)，分析其

2、重復(fù)類型和分布特點(diǎn);結(jié)合開發(fā)出的分布于全基因組水平的InDel標(biāo)記，分析在75份不同類型的大白菜自交系中擴(kuò)增的效果和多態(tài)性水平;通過(guò)HPLC（高效液相色譜）方法分別在苗期（定植后35天）和成熟期（適宜采收期）測(cè)定葉片硫甙含量，解析其變異特點(diǎn);通過(guò)關(guān)聯(lián)分析，獲悉與大白菜硫甙含量相關(guān)的SSR等位基因或位點(diǎn)及InDeL標(biāo)記。為分子標(biāo)記輔助選擇育種提供基礎(chǔ)材料，加快大白菜營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)育種的進(jìn)程。主要研究結(jié)果如下:
　　1.比對(duì)擬南芥和大白菜硫

3、甙生物合成相關(guān)基因的序列信息，發(fā)現(xiàn)擬南芥的52個(gè)硫甙合成基因在大白菜中的同源基因個(gè)數(shù)分別為:零拷貝基因8個(gè)、單拷貝基因13個(gè)、2拷貝基因17個(gè)、2個(gè)以上多拷貝基因14個(gè)。
　　2.根據(jù)102個(gè)大白菜硫甙生物合成相關(guān)基因的上下游序列各5kb，共開發(fā)出237個(gè)SSR位點(diǎn):16個(gè)基因沒(méi)有發(fā)現(xiàn)SSR位點(diǎn)，72個(gè)基因存在1～4個(gè)SSR位點(diǎn)，5個(gè)基因存在5個(gè)SSR位點(diǎn)，4個(gè)基因存在6個(gè)SSR位點(diǎn)，4個(gè)基因存在7個(gè)SSR位點(diǎn)，1個(gè)基因存在8個(gè)S

4、SR位點(diǎn);所開發(fā)的SSR位點(diǎn)中，共發(fā)現(xiàn)4種重復(fù)類型，其中單核苷酸重復(fù)最多，共122個(gè)，占SSR總數(shù)的51.4％。其次是二核苷酸類型，共48個(gè)，占SSR總數(shù)的20.3％。三核苷酸重復(fù)類型最少，共7個(gè)，占SSR總數(shù)的3.0％。另外60個(gè)SSR無(wú)明顯的重復(fù)類型。
　　3.具有SSR位點(diǎn)的86個(gè)基因中，77個(gè)基因可以設(shè)計(jì)特異SSR引物。其中，49對(duì)特異引物在大白菜自交系中得到有效擴(kuò)增，16對(duì)引物具有多態(tài)性，占全部引物的20.8％;18對(duì)引

5、物無(wú)多態(tài)性，占全部引物的23.4％;15對(duì)引物雜帶多，占全部引物的19.5％;另外28對(duì)引物無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，占全部引物的36.4％。最終，11對(duì)在供試的75份材料中獲得了清晰多態(tài)性擴(kuò)增產(chǎn)物,共檢測(cè)出26個(gè)等位基因，平均每對(duì)引物檢測(cè)到等位基因2.4個(gè)。
　　4.開發(fā)設(shè)計(jì)的177對(duì)InDel引物，161對(duì)在供試的75份大白菜自交系中得到有效擴(kuò)增，占全部引物的91.0％;61對(duì)獲得了清晰多態(tài)性擴(kuò)增產(chǎn)物，占全部引物的34.5％;61對(duì)引物共檢

6、測(cè)到161個(gè)多態(tài)性帶，平均每對(duì)引物檢測(cè)到2.6條帶。其中，95對(duì)引物只檢測(cè)到1條擴(kuò)增帶，31對(duì)檢測(cè)到2條擴(kuò)增帶，24對(duì)檢測(cè)到3條擴(kuò)增帶，6對(duì)檢測(cè)到4條擴(kuò)增帶。
　　5.在苗期，測(cè)定了68份大白菜自交系的葉片硫甙含量。結(jié)果表明不同基因型間各硫甙間含量差異較大，總硫甙含量變異幅度為0.734-11.189μmol/g DW;吲哚族硫甙平均含量高于脂肪族硫甙和芳香族硫甙，所占比例分別為49.9％、39.8％和10.6％。其中，3-吲哚-

7、甲基硫甙(GBC)含量最高，占總硫甙含量的27.0％;4-甲氧基-3-吲哚甲基硫甙(4ME)和4-戊烯基硫甙(GBN)含量較高，分別占總硫甙含量的18.0％和15.9％;4-羥基-3-吲哚-甲基硫甙(4OH)含量最低，僅占硫甙總含量的0.6％。
　　6.在成熟期，測(cè)定了68份大白菜自交系的葉片硫甙含量。結(jié)果表明不同基因型間各硫甙間含量差異較大，總硫甙含量變異幅度為1.918-17.357μmol/g DW;脂肪族硫甙和吲哚族硫甙的

8、平均含量高于芳香族硫甙，所占比例分別為48.6％、41.7％和9.7％。其中，2-羥基-3-丁烯基硫甙(PRO)、4-戊烯基硫甙(GBN)、4-甲氧基-3-吲哚甲基硫甙(4ME)和3-吲哚-甲基硫甙(GBC)含量相當(dāng)，分別占總硫甙含量的19.8％、19.7％、19.6％和19.0％。4-羥基-3-吲哚-甲基硫甙(4OH)含量最低，僅占硫甙總含量的0.7％。成熟期總硫甙和各個(gè)成分含量明顯高于苗期，相差約2倍。
　　7.GLM關(guān)聯(lián)分析