p55PIK-NFκB通路在炎癥調控中的作用及機制研究.pdf

1、本文主要分三部分進行了介紹：
　　第一部分蛋白 p55PIK對炎癥反應的調控作用
　　目的:磷脂酰肌醇-3-激酶蛋白家族(PI3Ks)蛋白同免疫反應密切相關,其調節(jié)亞單位和催化亞單位的表達缺失或應用相應的PI3Ks抑制劑能夠對免疫反應產生顯著影響。其中,IA類PI3Ks調節(jié)亞單位能夠通過其i-SH2結構域同相應的催化亞單位形成二聚體結構,進而調控催化亞單位的激酶活性。目前關于IA類PI3Ks亞單位對免疫反應尤其是炎癥反應的調

2、控作用存在較多爭議,本論文旨在明確IA類PI3Ks調節(jié)亞單位p55PIK對炎癥反應的調控作用,初步探討蛋白p55PIK對炎癥反應的調控作用的機制。
　　方法:擴增并純化表達蛋白p55PIK的腺病毒載體,在HaCat細胞內高表達蛋白p55PIK;通過在PMA誘導后的THP1細胞內轉染蛋白p55PIK特異性的siRNA,降低蛋白p55PIK的表達。通過單獨影響蛋白p55PIK的表達或者再次給予LPS(脂多糖)刺激,通過Q-PCR檢測相

3、應促炎細胞因子TNF-α,IL-1β,IL-6的轉錄水平的變化;通過ELISA試驗檢測相應促炎細胞因子TNF-α,IL-1β,IL-6的蛋白水平的變化;通過Western Blot檢測NFκB信號通路,PI3K/AKT通路,IKK信號通路以及MAPK信號通路的激活情況。
　　結果:成功擴增并純化表達蛋白p55PIK的腺病毒載體,成功篩選出蛋白p55PIK特異性的siRNA。在HaCat細胞內單獨高表達p55PIK或者再次給予LPS

4、刺激后均能夠顯著促進炎癥因子轉錄和翻譯(P<0.05),能夠激活NFκB信號通路和PI3K/AKT通路,但對IKK信號通路以及MAPK信號通路無明顯影響;在THP1細胞內單獨低表達p55PIK或者再次給予LPS刺激后均能夠顯著抑制炎癥因子轉錄和翻譯(P<0.05),能夠抑制NFκB信號通路和PI3K/AKT通路的激活,但對IKK信號通路以及MAPK信號通路無明顯影響。
　　結論:p55PIK能夠通過激活NFκB信號通路促進免疫細胞

5、炎癥因子轉錄和翻譯。高表達p55PIK能夠促進LPS誘導的炎癥因子轉錄,翻譯以及NFκB信號通路和PI3K/AKT通路激活。低表達p55PIK能夠抑制LPS誘導的炎癥因子轉錄翻譯,以及減少NFκB信號通路和PI3K/AKT通路的激活。
　　第二部分p55PIK對炎癥調控的相關機制初步研究
　　目的:初步探討蛋白 p55PIK對炎癥調控的相關機制。
　　方法:構建高表達蛋白 p55PIK的載體pcDNA3.1-p55PI

6、K,構建NFκB RelA報告基因載體。通過在Hela細胞內轉染NFκB RelA報告基因載體,同時低表達或者高表達蛋白p55PIK,觀察蛋白p55PIK對NFκB RelA轉錄活性的影響。通過pcDNA3.1-p55PIK在Hela細胞內高表達蛋白p55PIK,通過p55PIK腺病毒載體在HaCat細胞內高表達蛋白p55PIK。通過胞核胞漿分離試劑盒將細胞內核漿組分區(qū)別,Western Blot檢測胞核胞漿內蛋白p55PIK表達情況,

7、NFκB信號通路以及PI3K/AKT信號通路激活情況。通過免疫共沉淀尋找免疫過程可能與蛋白p55PIK相結合的NFκB信號通路蛋白。
　　結果:成功高表達蛋白p55PIK的載體pcDNA3.1-p55PIK,構建NFκB RelA報告基因載體。蛋白p55PIK能夠促進NFκB RelA轉錄活性,能夠正向調控LPS誘導的NFκB RelA轉錄激活。在Hela細胞內高表達蛋白p55PIK能夠促進胞漿蛋白IKBα的降解,在HaCat細胞

8、內高表達蛋白p55PIK能夠促進胞核蛋白IKBα的降解同時促進胞漿NFκB p65磷酸化的增加。免疫過程例如pV,PMA作用細胞可能促進蛋白p55PIK與NFκB信號通路蛋白NFκB p65結合。
　　結論:蛋白 p55PIK能夠通過促進NFκB RelA轉錄活性,正向調控炎癥反應。蛋白p55PIK與NFκB信號通路蛋白NFκB p65可能在免疫過程例如pV,PMA作用中相互結合。
　　第三部分穿膜融合多肽 IP55在炎癥治

9、療中的初步應用研究
　　目的:觀察穿膜融合多肽IP55預處理對免疫細胞(單核巨噬細胞系以及原代單核巨噬細胞)相應促炎因子產生的影響以及相關信號通路激活的影響。觀察穿膜融合多肽IP55預處理對LPS誘導的免疫細胞促炎因子釋放的影響。初步探索穿膜融合多肽IP55體內的炎癥治療作用。
　　方法:構建穿膜融合多肽IP55的原核表達載體,利用蛋白質純化技術和內毒素去除技術純化穿膜融合多肽IP55,以穿膜融合多肽IP55作用于單核巨噬細

10、胞系以及原代單核巨噬細胞后觀察對相應促炎因子 TNF-α, IL-6以及IL-1β產生的影響以及相應信號通路的變化。動物實驗觀察穿膜融合多肽IP55預防性治療對LPS誘導的急性小鼠肝損傷的保護作用。
　　結果:成功構建穿膜融合多肽IP55的原核表達載體pTAT-N15,在血液系統(tǒng)腫瘤細胞系Jurkat以及實體腫瘤Hela,IP55均能夠高效進入細胞,抑制腫瘤細胞細胞周期進程,抑制細胞內DNA合成;在單核巨噬細胞系THP1中,穿膜融

11、合多肽IP55預處理對促炎因子產生無明顯影響(P>0.05),對NFκB信號通路無激活,但能夠顯著抑制LPS誘導的單核巨噬細胞THP1促炎因子 TNF-α, IL-6以及IL-1β產生(P<0.05),部分抑制對NFκB信號通路的激活;在原代單核巨噬細胞內能夠部分抑制LPS誘導的單核巨噬細胞THP1促炎因子TNF-α產生(P<0.05),對其他促炎因子產生影響無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。體內實驗中,穿膜融合多肽IP55能夠部分抑制LP

12、S誘導的肝臟細胞NFκB p65的核轉位,降低LPS誘導的小鼠急性肝損傷造成的小鼠死亡率。
　　結論:穿膜融合多肽IP55能有效進入細胞,抑制腫瘤細胞細胞周期進程,抑制DNA合成;在單核巨噬細胞系采用穿膜融合多肽IP55預處理能夠顯著抑制LPS誘導的促炎因子TNF-α, IL-6以及IL-1β產生;在原代單核巨噬細胞采用穿膜融合多肽IP55預處理能夠部分抑制LPS誘導的單核巨噬細胞THP1促炎因子TNF-α產生;在LPS誘導的小鼠