反義TGFβRⅡ及反義TIMP-1聯(lián)合對實驗性肝纖維化影響的研究.pdf

1、背景：肝纖維化是機體對于慢性肝損傷的一種修復性應答。目前公認的發(fā)病機制主要是在肝臟多種細胞及細胞因子(CK)參與下，引起細胞外基質(ECM)的合成與降解失衡。TGFβ是目前己知最強烈的纖維化促進因子，可顯著增加ECM合成并間接抑制其降解。它必須活化后與受體結合才能發(fā)揮作用。其中Ⅰ、Ⅱ型受體在傳導TGFβ作用的信號通道中起主要作用，兩者缺一不可?，F(xiàn)已證明，肝纖維化時，一方面由于ECM產生增多，另一方面是因為調節(jié)ECM降解的基質金屬蛋白酶(

2、人為MMP-1，鼠為MMP-13)的活性被其主要特異性抑制劑TIMP-1所抑制，致使ECM的降解減少引起的。目前針對纖維化基因治療主要集中在單獨抑制TGFβRⅡ的表達以及單獨抑制TIMP-1的表達。針對TβRⅡ型受體及TIMP-1聯(lián)合反義治療的研究國內外尚未見報道。本研究旨在構建反義TβRⅡ真核細胞表達質粒，并將其與反義TIMP-1真核細胞表達質粒聯(lián)合導入大鼠肝纖維化模型中，觀察外源質粒對實驗性肝纖維化的影響，這可能有助于為將來臨床慢性

3、肝病肝纖維化的治療提供新的有效途徑。方法：查閱文獻，采用兩對套式引物，運用逆轉錄巢式PCR技術擴增TβRⅡ片段并經測序鑒定，雙酶切純化PCR產物及pcDNA3.1(+)，再將TβRⅡ反向插入pcDNA3.1(+)線性質粒，即構建成反義TβRⅡ/pcDNA3.1(+)真核細胞表達質粒。將反義質粒轉染感受態(tài)細胞JM-109，篩選陽性克隆行雙酶切鑒定及DNA測序分析。購得雌性SD大鼠90只，隨機分為：正常對照組(15只)，反義TβRⅡ+反義T

4、IMP-1質粒組(15只)、反義TβRⅡ質粒組(15只)、反義TIMP-1質粒組(15只)、pcDNA3.1(+)空質粒對照組(15只)、肝纖維化對照組(15只)。實驗中，除正常對照組外，其余以復合因素四氯化碳+飲用酒精+高脂高膽固醇飲食復制肝纖維化模型。各反義質粒組及空質粒對照組動物在模型制作兩周后，每隔9天經腹腔給予脂質體包埋好的質粒100μg。最后一次CCl4攻擊后2天宰殺實驗動物，取動物肝組織。采用HE染色、VG染色觀察肝組織病

5、理形態(tài)學變化，應用免疫組化測定動物肝組織中Ⅰ型膠原、TβRⅡ、TIMP-1、MMP-13蛋白水平的表達。實驗結果采用SPSS軟件11.0作單因素方差分析，病理形態(tài)學觀察結果作非參數(shù)檢驗。 結果：反義TβRⅡ/pcDNA3.1(+)真核細胞表達質粒構建成功；實驗過程中空質粒組死亡率為7％，在正常范圍；正常對照組、反義TβRⅡ+反義TIMP-1質粒組、反義TβRⅡ質粒組、反義TIMP-1質粒組、pcDNA3.1(+)空質粒組、肝纖維

6、化組Ⅰ型膠原的蛋白表達的灰階值分別為：170.450±5.694、154.410±4.877、144.984±2.629、146.008±5.630、133.470±3.932、134.547±4.750；正常對照組、反義TβRⅡ質粒組、空質粒組、肝纖維化組的TβRⅡ蛋白表達的灰階值分別為：155.677±6.010、124.442±4.088、115.190±6.839、115.064±5.720；正常對照組、反義TIMP-1質粒組、

7、空質粒組、肝纖維化組TIMP-1的蛋白表達的灰階值分別為：135.791±3.546、114.661±5.285、95.356±5.113、94.864±4.538，正常對照組、反義TIMP-1質粒組、空質粒組、肝纖維化組MMP-13蛋白表達的灰階值分別為：152.983±5.674、134.933±3.120、104.919±4.090、104.808±3.634；與空質粒組、纖維化組相比，各反義質粒組Ⅰ型膠原蛋白表達下降(P＜0.0

8、5)，反義TβRⅡ質粒組TβRⅡ蛋白表達下降(P＜0.05)，反義TIMP-1質粒組TIMP-1、MMP-13蛋白表達下降(P＜0.05)。正常對照組與各實驗組之間的病理學分級有顯著性差異(P＜0.05)，反義TβRⅡ質粒組、反義TIMP-1質粒組病理學分級均較纖維化組、空質粒組有明顯改善(P＜0.05)。反義TβRⅡ+反義TIMP-1質粒組病理學分級較反義TβRⅡ質粒組、反義TIMP-1質粒組有明顯改善(P＜0.05)?？召|粒組與肝纖

9、維化組無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。反義TβRⅡ質粒組與反義TIMP-1質粒組無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。 結論：1、反義TβRⅡ佃cDNA3.1(+)真核細胞表達質粒構建成功。 2、復合因素復制大鼠肝纖維化模型成功。 3、單獨運用反義TβRⅡ/pcDNA3.1(+)真核細胞表達質粒、反義TIMP-1佃cDNA3.1(+)真核細胞表達質粒均可改善肝纖維化大鼠的病理學分級；并且減少Ⅰ型膠原蛋白的沉積。 4

10、、聯(lián)合運用這兩種真核細胞表達質粒能夠改善肝纖維化大鼠的病理學分級，并且減少Ⅰ型膠原蛋白的沉積，效果優(yōu)于單獨使用。 5、反義TβRⅡ/pcDNA3.1(+)真核細胞表達質粒能夠減少TβRⅡ的表達，阻斷TGFβ通路。 6、反義TIMP-1/pcDNA3.1(+)真核細胞表達質粒能夠減少TIMP-1、MMP-13的表達，在一定程度上恢復MMP-13的部分活性。 7、聯(lián)合運用這兩種真核細胞表達質?？梢匝泳弻嶒炐源笫蟾卫w維