轉(zhuǎn)染hVEGF165-GFP基因的內(nèi)皮祖細胞對兔MODS模型微血栓形成影響的實驗性研究.pdf

1、內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cell，EPC)是存在于外周血、骨髓及組織中，具備定向分化為成熟血管內(nèi)皮潛能的前體細胞，是一類干細胞群體的總稱。在創(chuàng)傷、炎癥及失血所導致的組織損傷過程中，骨髓中的EPC可被大量動員，釋放入外周血，在VEGF、SDF-1等趨化因子的作用下富集于損傷部位，修復血管內(nèi)皮，改善局部血供，對組織的修復有著重要的意義。近年來，體外培養(yǎng)EPC用于治療缺血性疾病及炎癥損傷已得到廣泛的研究。

2、r>　　 多器官功能障礙綜合征(MODS)是指機體遭受嚴重創(chuàng)傷、休克或感染24h后同時或序貫出現(xiàn)2個或2個以上的系統(tǒng)或器官的功能障礙，是多種疾病最嚴重的并發(fā)癥和最終結(jié)局。創(chuàng)傷及感染是發(fā)生MODS的兩個重要誘因，兩者均可激活炎癥細胞及因子，使機體產(chǎn)生過度的應激及炎癥反應，內(nèi)皮細胞是炎癥介質(zhì)首先打擊的靶細胞，其損傷和功能紊亂，導致炎癥反應的放大，內(nèi)環(huán)境無法保持穩(wěn)態(tài)，導致MODS的發(fā)生。
　　 本實驗通過以慢病毒載體介導hVEGF1

3、65-GFP基因轉(zhuǎn)染EPC，并觀察其對雙相遲發(fā)MODS動物模型臟器功能、微循環(huán)改變的影響，研究異體移植EPC對MODS的治療作用及相關(guān)機制，并探尋其更優(yōu)方案。
　　 本實驗共分為三個部分：一、體外分離、培養(yǎng)及鑒定兔骨髓來源的EPC，檢測其增殖、分化及成血管能力，為異體移植提供可靠的技術(shù)平臺和細胞來源；二、構(gòu)建慢病毒載體，將VEGF-GFP目的基因轉(zhuǎn)染入EPC，監(jiān)測細胞增殖功能變化；三、異體移植EPC用于治療MODS動物，觀察移植

4、后重要臟器功能改變、微循環(huán)中血栓形成情況以及內(nèi)皮祖細胞相關(guān)細胞因子(MCP-1，ANG-1)的表達情況，評價轉(zhuǎn)染VEGF-GFP雙表達基因的EPC對MODS的治療效果。
　　 第一部分家兔骨髓來源內(nèi)皮祖細胞的培養(yǎng)及鑒定
　　 本部分旨在建立起家兔骨髓來源的EPC的標準化分離、培養(yǎng)、擴增及鑒定的方法，為下一步病毒轉(zhuǎn)染及EPC移植治療MODS的研究提供技術(shù)平臺及細胞來源。
　　 密度梯度離心法分離家兔骨髓，提取、純化

5、單個核細胞，按照1×105/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，以含有多種促生長因子(VEGF、bFGF)及胎牛血清的內(nèi)皮祖細胞專用培養(yǎng)液培養(yǎng)及誘導分化，觀察細胞形態(tài)、數(shù)量變化，并進行傳代擴增。對培養(yǎng)的P3代EPC進行形態(tài)學特征、超微結(jié)構(gòu)、表面抗原(CD133、CD31、KDR)及吞噬實驗(FITC-UEA-1、Dil-ac-LDL)、體外血管生成功能等檢測及鑒定，以確認培養(yǎng)的細胞即是EPC，為后文的移植治療做好準備工作。
　　 結(jié)果顯

6、示：培養(yǎng)24-48小時后即出現(xiàn)梭形貼壁細胞，培養(yǎng)6-8天為細胞增殖高峰，可觀察到集落形成。消化傳代后，檢測P3代細胞，電鏡下可見內(nèi)皮細胞特異性標志7Weibel-Palade小體；細胞表面抗原檢測表明CD133陽性率為4％，，CD31及KDR陽性率超過90％；貼壁細胞可特異性攝取了Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1，表現(xiàn)出內(nèi)皮細胞的特征。P3代細胞體外生成血管功能檢測提示細胞間可相互連接，生成毛細血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。本部分實驗從兔骨髓

7、中分離出單個核細胞，并成功誘導分化出帶有干細胞表型及血管內(nèi)皮細胞特征，能有效形成毛細血管結(jié)構(gòu)的EPC。
　　 第二部分慢病毒載體的構(gòu)建和內(nèi)皮祖細胞的轉(zhuǎn)染
　　 本實驗部分構(gòu)建hVEGF/GFP雙表達基因慢病毒載體，并轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細胞，為下一步的細胞移植治療MODS提供相關(guān)的細胞來源。
　　 將預先構(gòu)建的hVEGF165-GFP雙表達盒連接至穿梭質(zhì)粒pDC315的多克隆位點上。得到重組穿梭質(zhì)粒pDC315-

8、hVEGF165-GFP。利用酶切技術(shù)，將hVEGF165-GFP目的片段連接于慢病毒載體的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒上，構(gòu)建FUGW/hVEGF165-GFP轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，將慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒FUGW/hVEGF165-GFP，包裝質(zhì)粒pCMVR-delta8.9及包膜質(zhì)粒VSVG通過磷酸鈣法三質(zhì)粒瞬時共轉(zhuǎn)染293 FT細胞，得到LV/hVEGF165-GFP，將LV/hVEGF165-GFP與EPC共培養(yǎng)以感染EPC。檢測轉(zhuǎn)染后細胞增殖能力。結(jié)果表明，目的基

9、因插入慢病毒過表達載體pWPXL-MOD后PCR擴增載體片段與目的片段均可表達；EPC經(jīng)轉(zhuǎn)染hVEGF-GFP雙表達基因后均能穩(wěn)定表達VEGF及GFP，且細胞增殖能力較未轉(zhuǎn)染前顯著提高。
　　 第三部分轉(zhuǎn)染hVEGF165-GFP基因內(nèi)皮祖細胞對兔MODS模型微血栓形成的影響
　　 本部分實驗在構(gòu)建MODS動物模型的基礎(chǔ)上，予異體移植體外培養(yǎng)的EPC及轉(zhuǎn)染hVEGF-GFP雙表達基因的EPC，觀察重要臟器的功能變化及微循

10、環(huán)中血栓的形成情況，并檢測EPC旁分泌功能相關(guān)細胞因子，以了解EPC移植對MODS的治療作用及相關(guān)機制，并探索其更優(yōu)方案。
　　 健康家兔36只，隨機分為三組，予失血性休克及內(nèi)毒素打擊，構(gòu)建MODS模型；未治療動物12只作為對照組(M組)；12只動物行單純EPC移植(ET組)；12只動物予轉(zhuǎn)染hVEGF-GFP雙表達基因內(nèi)皮祖細胞。移植時間點為內(nèi)毒素打擊后1小時，移植數(shù)量為1×107/公斤體重，監(jiān)測臟器功能變化，動物死亡或觀察9