自噬在涎腺腺樣囊性癌化療中的作用及其相關蛋白與臨床預后的相關性.pdf

1、第一部分：自噬在涎腺腺樣囊性癌順鉑化療中的作用
　　 研究目的：
　　 1.分析應用自噬抑制劑對順鉑(cis-Dichlorodiamineplatinum，DDP)誘導涎腺腺樣囊性癌細胞死亡和細胞凋亡的影響。
　　 2.分析應用轉染技術沉默自噬基因抑制自噬對涎腺腺樣囊性癌細胞死亡和細胞凋亡的影響。
　　 3.分析Bcl-2在DDP誘導涎腺腺樣囊性癌細胞自噬和細胞凋亡中的變化。
　　 4.分析P5

2、3-AMPK-mTOR相關蛋白是否參與了DDP誘導的自噬反應。
　　 5.分析自噬抑制劑在DDP治療ACC-M移植瘤中的作用。
　　 研究方法：
　　 1.MTT實驗及流式細胞儀分別檢測應用自噬抑制劑或沉默自噬基因抑制自噬前后DDP誘導涎腺腺樣囊性癌細胞死亡和細胞凋亡的變化。Western blot檢測凋亡蛋白actived-caspase-3。
　　 2.電鏡及熒光顯微鏡檢測DDP誘導涎腺腺樣囊性癌細胞

3、自噬的變化。Western blot檢測自噬標志蛋白LC3。
　　 3.Western blot檢測Bcl-2及P53-AMPK-mTOR相關蛋白。
　　 4.構建ACC-M移植瘤，檢測應用自噬抑制劑前后腫瘤體積及重量的變化，免疫組化檢測實體瘤中自噬標志蛋白LC3的變化。
　　 研究結果：
　　 1.3-MA增加DDP誘導涎腺腺樣囊性癌細胞死亡，同時促進癌細胞凋亡。
　　 MTT結果顯示DDP處理

4、ACC-M細胞的24小時IC50為11.34±0.92μg/mL。因此，在隨后的實驗中使用，采用濃度為10μg/mLDDP處理ACC-M24小時。與對照組相比，DDP療組的ACC-M細胞活力下降了約61.02％;3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)和DDP聯合治療組的細胞死亡率增加了約78.73％。3-MA組的細胞死亡率較對照組無明顯差別。
　　 用流式細胞儀AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)染色

5、檢測細胞凋亡;用Westernblot檢測actived-caspase-3。與DDP組相比，DDP和3-MA聯合處理組的ACC-M細胞凋亡率顯著增加，從19.08％增加到約29.72％。通過Westernblot檢測下游凋亡通路的capase-3的活性形式cis-Dichlorodiamineplatinumactived-caspase-3。與DDP組相比，3-MA和DDP聯合治療組中的actived-caspase-3增加了約36

6、.36％。
　　 3-MA是一個眾所周知的自噬抑制劑，它可抑制typeⅠPI3K活性，而typeⅠPI3K是自噬體形成過程中必不可少的因子;DDP可誘導細胞自噬，這些在我們的實驗中被再次證實。我們在電子顯微鏡下發(fā)現DDP誘導ACC-M細胞產生的自噬體。為了證實3-MA可抑制順鉑誘導ACC-M細胞自噬，我們用GFP-LC3質粒轉染細胞并檢測GFP分布。LC3是一種微管相關蛋白，是自噬體的重要組成部分。GFP-LC3質粒轉染細胞已成

7、為一個檢測自噬體有效的手段。在對照組中，觀察到ACC-M細胞胞漿中散在點狀熒光，而DDP處理的細胞表現出點狀熒光增加，且表達點狀熒光的細胞數明顯增加。點狀熒光增加表明自噬細胞的存在。研究發(fā)現DDP和3-MA聯合治療組與順鉑組相比，表達點狀熒光細胞減少了約64.29％。
　　 LC3-Ⅰ轉換成LC3-Ⅱ的程度與細胞自噬的水平正相關，Westernblot檢測LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ帶密度代表自噬水平。順鉑治療誘導ACC-M細胞LC3

8、-Ⅱ表達，但3-MA使其表達減少約52.83％。除了LC3用作自噬的檢測外，p62/SQSTM1蛋白作為LC3和泛素化底物之間的連接，也被用于自噬的檢測。Westernblot檢測發(fā)現DDP和3-MA聯合治療組與順鉑治療組相比，p62的蛋白水平增加了約36.51％。
　　 總體而言，順鉑(DDP)治療誘導了ACC-M細胞自噬，但3-MA抑制了細胞自噬和增強了DDP誘導ACC-M的細胞死亡，增加了caspase途徑的細胞凋亡。

9、r>　　 2.Beclin-1siRNA促進涎腺腺樣囊性癌的細胞凋亡，增加癌細胞死亡。
　　 Beclin-1是自噬過程中的一個關鍵的起始蛋白質。為了更直接的觀察抑制自噬的對涎腺腺樣囊性癌細胞的影響，我們使用Beclin-1siRNA降低內源性beclin-1的表達。轉染后24小時，Western blot檢測到干擾后ACC-M細胞中內源性Beclin-1與對照組相比，減少了約56.60％。
　　 此外，采用流式細胞儀

10、AnnexinV-PE和7AAD的染色檢測細胞凋亡率和Western blot檢測actived-caspase-3。與DDP組相比，DDP和Beclin-1siRNA聯合組ACC-M細胞的凋亡率顯著增加:從18.78％增加到30.41％。此外，與DDP組相比，DDP和Beclin-1siRNA聯合組actived-caspase-3增加了35.19％。
　　 在我們的實驗中證實了DDP誘導細胞自噬和Beclin-1siRNA抑

11、制自噬。我們觀察到，與DDP組相比，DDP與Beclin-1siRNA聯合組中ACC-M自噬細胞減少了約80.32％。DDP組ACC-M細胞中LC3-Ⅱ明顯增加，但與DDP組相比，DDP和Beclin-1siRNA聯合組LC3-Ⅱ減少了約61.11％。相應地，與DDP治療相比，DDP和Beclin-1siRNA聯合組的p62蛋白表達增加了約100％。
　　 總體而言，順鉑(DDP)誘導了ACC-M細胞自噬，BeclinlsiRN

12、A抑制細胞自噬和增強了DDP誘導ACC-M細胞死亡，提高了caspase途徑細胞凋亡。
　　 3.Bcl-2蛋白可能是細胞凋亡和自噬之間的聯系蛋白;P53-AMPK-mTOR信號通路可能參與了DDP誘導的自噬反應。
　　 以上結果發(fā)現DDP誘導的細胞凋亡和自噬之間可能有串擾，因此我們檢測了Bcl-2的表達。通過Western blot分析，我們發(fā)現DDP可提高ACC-M細胞中Bcl-2的表達，而Beclin-1siRNA

13、可使增加的Bcl-2減少。因此，在我們的實驗中Bcl-2蛋白可能是自噬和凋亡途徑之間的聯系蛋白。
　　 此外，我們探索了DDP誘導自噬的基本機制。通過Western blot法，我們發(fā)現在ACC-M細胞中DDP處理組腫瘤抑制基因P53和AMP激活的蛋白激酶(AMPK)磷酸化增加，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)磷酸化顯著下降。
　　 4.DDP和3-MA聯合對ACC-M移植瘤的抗癌作用。
　　 為了進一步驗證自

14、噬在體內涎腺腺樣囊性癌細胞的作用，我們構建了ACC-M裸鼠移植瘤。結果顯示各分組之間荷瘤鼠體重無顯著差異。與順鉑組及空白對照組相比，順鉑和3-MA聯合組的腫瘤生長被顯著抑制。與空白對照相比，3-MA組的腫瘤生長沒有明顯變化。30天時，與DDP組相比較，順鉑和3-MA聯合組的小鼠腫瘤體積和腫瘤重量分別顯著減少了53.64％和59.75％。免疫組織化學分析結果示DDP組移植瘤組織中LC3的表達明顯高于其他三組。這些結果表明DDP和3-MA聯

15、合能夠抑制涎腺腺樣囊性癌細胞自噬及其移植瘤的生長。
　　 結論：
　　 1.3-MA增加DDP誘導涎腺腺樣囊性癌細胞死亡，同時促進癌細胞凋亡。
　　 2.Beclin-1siRNA促進涎腺腺樣囊性癌的細胞凋亡，增加癌細胞死亡。
　　 3.Bcl-2蛋白可能是細胞凋亡和自噬之間的聯系蛋白;P53-AMPK-mTOR信號可能參與了DDP誘導的自噬反應。
　　 4.DDP和3-MA聯合對ACC-M移植瘤

16、的抗癌作用。
　　 第二部分：自噬相關相關蛋白和內質網應激相關蛋白在頭頸部涎腺腺樣囊性癌中的表達
　　 自噬是細胞內源性途徑，它在細胞應激和營養(yǎng)缺乏狀態(tài)下可維持能量平衡和高分子合成，促進細胞存活。內質網應激是在細胞應激和營養(yǎng)缺乏狀態(tài)下生理功能的中斷導致未折疊蛋白的積累和誘導未折疊蛋白應答的過程。內質網應激和自噬均與人類癌癥有關。我們研究了自噬相關蛋白（LC3和Beclin1）和內質網應激相關蛋白(GRP78)在頭頸部涎腺

17、腺樣囊性癌組織中的表達。79例頭頸部腺樣囊性癌組織的組織標本制成組織微陣列芯片用于免疫組化。LC3的表達與淋巴結轉移(P=0.016)及TNM分期(P=.021)顯著相關。Beclin1的表達組織增長模式(P=0.002)，組織學分級(P<.001)及survivial(P<.OOl)顯著相關。GRP78的表達組織增長模式(P=0.019)，組織學分級(P=0.019)及survivial(P=0.001)顯著相關。LC3的表達與Bec

18、lin1的表達(P　　 自噬與腫瘤發(fā)生