牙鲆抗淋巴囊腫病相關微衛(wèi)星標記的篩選及兩種免疫相關基因的克隆與初步分析.pdf

1、牙鲆（Paralichthys olivaceus）是我國重要的海水養(yǎng)殖魚類，經(jīng)濟價值較高，被廣泛養(yǎng)殖。近年來，隨著牙鲆養(yǎng)殖規(guī)模不斷壯大，各種病害頻繁發(fā)生。為了牙鲆養(yǎng)殖業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展，應采取傳統(tǒng)育種與分子手段相結合的手段培育性能更好的新品種。本文以牙鲆為材料，篩選出了與牙鲆抗淋巴囊腫病相關的微衛(wèi)星標記，并對兩種免疫相關基因進行了克隆及初步分析。得到了一以下結果:
　　Ⅰ、牙鲆抗淋巴囊腫病相關微衛(wèi)星分子標記的篩選
　　為了篩

2、選出中國牙鲆群體的抗淋巴囊腫病相關 SSR標記，采用分群分析法對102個牙鲆個體（感病56個，抗病46個）進行了抗淋巴囊腫病相關SSR標記的篩選。首先構建了抗、感基因池（抗病個體和感病個體各15個），并利用178對微衛(wèi)星引物對其進行了掃描；對于在抗、感池間擴增出差異條帶的引物，用構成抗、感池的30個個體對其進行了第一次單個體驗證；對于在第一次單個體驗證中差異顯著的引物用102個個體進行了第二次驗證。結果顯示，有4對引物（scaffold

3、440_22585、scaffold826_5003、scaffold703_4284和scaffold185_597）在抗、感基因池間擴增出了差異條帶；經(jīng)第一次單個體驗證，表明scaffold826_5003（P=0.023）和scaffold185_597（P178bp=0.028，P173bp=0.009）的差異條帶在抗、感個體中呈顯著性差異；經(jīng)第二次單個體驗證，發(fā)現(xiàn)scaffold185_597的差異條帶在抗、感個體中出現(xiàn)的頻率

4、分別為60.9％和14.3%（P=0.001），差異顯著；對scaffold185_597在10個抗病個體中擴出的差異條帶進行了克隆并測序，經(jīng) blast比對，證實其為黃海所水產(chǎn)基因組與細胞工程研究室公布的牙鲆微衛(wèi)星標記scaffold185_597中的一段，同源性達到96%。研究表明微衛(wèi)星標記 scaffold185_597可能與牙鲆抗淋巴囊腫病相關，為中國牙鲆分子標記輔助育種提供了參考。
　　Ⅱ、牙鲆免疫相關基因的克隆與初步分

5、析
　　選用補體相關基因C1q-like3和胞粘蛋白因子基因Cytohesin-1，采用cDNA末端快速擴增技術，對兩個基因分別進行了克隆，并對其結構進行了分析。之后，對牙鲆C1q-like3基因進行了轉錄組水平的表達分析；并在牙鲆Cytohesin-1基因中篩查了單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點。從而對兩種免疫相關基因的功能與牙鲆抗病的關聯(lián)性進行了分析。
　　1.C1ql3基因的克隆與表達分析
　　補體系統(tǒng)是一種重要的免

6、疫效應系統(tǒng)，在先天性免疫中起著非常重要的作用。補體相關分子廣泛存在，并參與宿主的免疫應答。研究克隆了牙鲆C1q-like3基因（定義為PoC1ql3）。PoC1ql3的cDNA全長1482bp，包括4bp的5’UTR，801bp的編碼區(qū)和677bp的3’UTR。801bp的開放閱讀框編碼266個氨基酸，與其基因組序列比對發(fā)現(xiàn)該基因含有兩個外顯子和一個內含子。同源比對和進化分析表明，牙鲆C1ql3基因與斑馬魚和羅非魚親緣關系很近。健康組織

7、C1ql3的實時定量分析顯示PoC1ql3在肝臟和脾臟中高表達，在血液和肌肉中很少表達，并在其他組織中低表達。鰻弧菌感染后，C1ql3在肝中的表達在6h達到最高峰，在脾中則在48h上升到最大值，分別是其PBS對照組的2.89和2.64倍。細菌的感染能顯著增加PoC1ql3在免疫組織中的表達，這可能說明了C1ql3與牙鲆炎癥反應和自我平衡功能相關。
　　2.Cytohesin-1基因的克隆與SNP檢測
　　Cytohesin-

8、1基因在小鼠、人類等物種的研究表明，其在機體中發(fā)揮免疫功能的作用，與免疫調節(jié)具有一定的相關性。研究通過基因克隆技術獲得了牙鲆Cytohesin-1基因的cDNA全長序列1631bp，包括175bp的5’UTR，1203bp的開放閱讀框和253bp的3’UTR。1203bp的開放閱讀框共編碼400個氨基酸。cDNA序列與基因組序列比對結果顯示，牙鲆 Cytohesin-1基因含有11個外顯子和10個內含子。多氨基酸序列比對表明，該基因在各