置換探針實時PCR檢測微生物耐藥突變.pdf

1、本論文應用熒光置換探針技術，以乙型肝炎病毒在拉米夫定治療過程中產生的耐藥突變和多重耐藥結核分枝桿菌為研究對象，考察熒光置換探針用于低GC含量和高GC含量突變基因的多位點檢測情況，建立了可應用于多突變位點病原微生物檢測的多色均相熒光PCR系統(tǒng)。 快速有效的檢測乙型肝炎病毒抗拉米夫定耐藥突變，對于臨床診斷和治療具有重要的意義。本論文建立了于單管實時PCR實驗中同時檢測血清標本中存在的多個拉米夫定耐藥突變的體系。應用4對標記了不同熒光

2、基團的堿基特異性置換探針，通過單個實時PCR反應就能判斷標本中包含了以下任何一種HBV DNA：野生型，rtM204突變型，野生和rtM204突變混合型，rtM204突變和rtL180突變混合型，野生、rtM204突變和rtL180突變混合型。我們考察了檢測體系的靈敏度、特異性和檢測雜合比例的能力，并應用該體系完成了50份已知包含拉米夫定耐藥突變的HBV血清標本和36份HBeAg陽性的HBV血清標本的檢測。檢測結果表明，和DNA測序結果

3、相比，該體系表現(xiàn)出更高的靈敏度和更強的檢測雜合比例的能力。該方法可以檢測出低至102～103copies/mL的HBV，并且可以檢測出在大量的野生型DNA中的5％的突變型DNA。應用這種高通量的檢測體系能夠對抗拉米夫定HBV進行更早的診斷。 目前臨床上用于檢測結核分枝桿菌對抗菌藥物的敏感性的方法，因為受到細菌生長速度的限制，一般需要數(shù)周的時間，不利于臨床診斷和治療。針對4種治療結核的一線藥物，在確定結核分枝桿菌存在的前提下，本論

4、文建立了兩個檢測結核分枝桿菌耐藥突變的體系： 一是針對結核分枝桿菌抗利福平耐藥突變中最常見的RNA聚合酶基因(rpoB)突變，建立了在單管PCR反應中實時檢測rpoB核心位點發(fā)生的所有突變的體系。在結核分枝桿菌耐利福平分離株中，95％的突變發(fā)生在rpoB507位至533位27個氨基酸密碼子(81bp)組成的區(qū)域內。應用4對標記了不同熒光基團的堿基特異性置換探針，覆蓋rpoB 81bp的大部分區(qū)域，一旦所檢測的區(qū)域發(fā)生了突變就會造

5、成相應探針的熒光信號的消失，從而達到檢測突變的目的。結果表明，該體系可以檢測出低至5個拷貝的結核分枝桿菌，并且具有很高的特異性。應用該體系完成了9份已知基因型的結核分枝桿菌培養(yǎng)標本和123份痰標本的檢測。痰標本中101份為野生型，5份526位點發(fā)生突變，16份531位點發(fā)生突變，1份526和531位點同時突變。所有檢測結果均通過DNA測序驗證。 二是建立了同時檢測三種一線藥物的結核分枝桿菌耐藥突變的熒光PCR檢測方法。將熒光雙鏈

6、置換探針、實時PCR和多重PCR相結合，針對三種一線藥物鏈霉素、異煙肼和乙胺丁醇中最常見的并且都是由于點突變而導致的耐藥突變位點進行檢測。應用該體系檢測了9份已知基因型的結核分枝桿菌培養(yǎng)標本和118份痰標本，其中93份痰標本未發(fā)生突變，8份痰標本發(fā)生耐鏈霉素突變，6份痰標本發(fā)生耐異煙肼突變，1份痰標本發(fā)生耐乙胺丁醇突變，2份痰標本發(fā)生同時耐鏈霉素和異煙肼的突變，8份痰標本發(fā)生同時耐鏈霉素、異煙肼和乙胺丁醇的突變，所有檢測結果均通過ARM