鋅與鋅轉運體在脊髓和DGR的分布以及鋅在NPP中的作用和機制.pdf

1、鋅是哺乳動物體內重要的微量元素之一，在機體的生長發(fā)育、生殖遺傳、免疫、內分泌、神經活動等重要生理過程中發(fā)揮重要的作用。在中樞神經系統(tǒng)中，大約15％的鋅離子處于游離狀態(tài)，這些鋅離子主要位于含鋅神經元(zinc—enriched neuron，ZEN)軸突末端的突觸小泡內。當神經活動時，游離鋅離子往往隨著一些神經遞質的釋放而進入突觸間隙并與突觸后膜的某些受體結合或者穿越突觸后膜進入到突觸后神經元，從而發(fā)揮其神經調節(jié)作用。近年來人們對鋅轉運體

2、(zinc transporters，ZNTs)的研究進一步揭示了鋅的生物學功能，ZNT7就是其中一個重要組成成員，它的功能是將鋅轉運到高爾基體內，從而維持細胞內的鋅穩(wěn)態(tài)。 神經病理性疼痛(neuropathic pain，NPP)是一種由神經系統(tǒng)損傷而引起的慢性疾病，臨床上以痛覺過敏、觸誘發(fā)痛(或稱痛覺超敏)、局部感覺缺失以及自發(fā)性疼痛等為特點。近年來，隨著人口的老齡化，NPP的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，但是由于缺乏有效的治療手段

3、，已經成為危害人類健康的主要疾病之一。 基礎研究表明，鋅能影響NMDA和非NMDA受體的表達與功能，后者在傷害性刺激傳導中起重要作用；金屬硫蛋白—Ⅲ和游離鋅離子以及含鋅初級傳入神經元在脊髓和背根神經節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)的大量分布也提示鋅可能參與痛覺的傳導。動物實驗顯示，脊神經背根切斷術后，小鼠痛閾明顯降低，脊髓背側角淺層灰質的鋅離子明顯減少，進一步證實鋅可能參與痛覺的產生和傳導。 因此，

4、本研究利用金屬自顯影技術(autometallography，AMG)、免疫組織化學、免疫熒光雙標記與共聚焦激光掃描顯微鏡技術、Westein blot技術研究鋅及ZNTs在小鼠脊髓和DRG的分布。在此基礎上，利用坐骨神經分支選擇損傷模型(spared nerve injury，SNI)觀察低鋅和高鋅預處理對SNI模型動物行為學變化以及脊髓和DRG中鋅離子、神經肽、神經元凋亡和星形膠質細胞的影響，從而為探討脊髓和DRG中的鋅代謝以及鋅在

5、NPP產生與傳導中的作用和機制研究提供重要的實驗依據(jù)。 實驗方法： 應用AMG技術、免疫組織化學技術、Western Blot技術檢測鋅和ZNT7在CD—1小鼠脊髓和DRG的分布，應用免疫熒光雙標記和共聚焦激光掃描顯微鏡技術檢測ZNT7與TGN38在小鼠脊髓和DRG的定位分布及其位置關系。建立SNI動物模型，利用觀察動物自主行為變化與行為學檢測技術對模型進行鑒定。在此基礎上，分別給予低鋅或高鋅預處理，觀察鋅預處理對SNI

6、模型動物行為學的影響。同時，利用AMG技術、N—(6—甲基—8—喹啉)—甲苯磺酰胺熒光染色技術(N—(6—methoxy—8—quinolyl)-Para-Toluenesulfonamide，TSQ)檢測鋅在各組模型動物脊髓和DRG的分布變化；利用免疫組織化學技術、Western Blot技術和免疫熒光技術檢測鋅預處理對SNI模型動物脊髓和DRG中的降鈣素基因相關肽(calcitonin gene related protein，CG

7、RP)、神經肽Y(neuropeptide Y，NPY)、細胞凋亡因子和星形膠質細胞表達的影響。 實驗結果： 1、鋅離子在CD—1小鼠脊髓和DRG的分布 AMG陽性反應產物為棕黑色顆粒，主要分布在小鼠脊髓的神經元軸突終末和DRG神經元細胞核的周圍，呈斑塊狀或顆粒狀圍繞細胞核。 2、ZNT7在CD—1小鼠脊髓和DRG的分布 免疫組織化學結果顯示：ZNT7免疫陽性反應產物呈棕黃色，在脊髓灰質的神經元

8、以及DRG神經元的細胞核周圍均可見ZNT7陽性產物分布，呈斑塊狀或顆粒狀圍繞在細胞核周圍高爾基體的分布區(qū)域。 免疫熒光雙標記和共聚焦激光掃描結果顯示：在小鼠脊髓灰質和DRG的神經元細胞核周圍均有ZNT7陽性產物的表達，其與TGN38的分布相同，均呈斑塊狀或顆粒狀共分布于神經元細胞核周圍。 3、ZNT7在CD—1小鼠脊髓內表達的Western Blot分析 應用Western Blot技術對小鼠脊髓內ZNT7在蛋白

9、水平的表達進行檢測。結果顯示，小鼠的脊髓內有ZNT7的豐富表達。 4、SNI模型的鑒定 觀察動物自主行為發(fā)現(xiàn)：假手術組(SHAM)術后第2天步態(tài)基本恢復正常，無甩足和舔足等自發(fā)痛行為；而SNI模型動物在術后第1天就開始跛行，術側后足不敢承重，出現(xiàn)甩足和舔足等自發(fā)痛行為，一直持續(xù)到觀察期末。 機械性痛閾檢測表明：與術前基礎痛閾值相比，SHAM組術后痛閾無明顯下降，差異無顯著性意義(P>0.05)；SNI組術后痛閾明

10、顯下降，差異有顯著性意義(P<0.05)。與SHAM組相比，SNI組術后機械痛閾顯著降低，差異有顯著性意義(P<0.05)，表明模型制備成功。 5、低鋅或高鋅預處理對SNI模型動物脊髓背側角和DRG中鋅離子的影響 AMG和TSQ檢測結果顯示：與SHAM組相比，正常動物模型組(N—SNI)與低鋅預處理組(L—SNI)的術側脊髓背側角淺層和DRG中的鋅離子均顯著減少(P<0.05)，其中L—SNI組比N—SNI組減少更為顯

11、著(P<0.05)；而高鋅預處理組(H—SNI)術側脊髓背側角淺層和DRG中的鋅離子均顯著增多(P<0.05)。 6、鋅對SNI模型動物行為學的影響 觀察動物自主行為發(fā)現(xiàn)：SHAM組術后第2天步態(tài)基本恢復正常，無舔足和甩足等自發(fā)痛行為；而N—SNI、L—SNI和H—SNI組在術后第1天就開始跛行，術側后足不敢承重，出現(xiàn)甩足、舔足等自發(fā)痛行為，一直持續(xù)到觀察期末。此外，L—SNI組小鼠的自主行為最為顯著，而H—SNI組的自

12、主行為相對較輕。 機械性痛閾檢測表明：與術前基礎痛閾值相比，N—SNI、L—SNI和H—SNI組術后痛閾均明顯下降，差異有顯著性意義(P<0.05)；與SHAM組相比，N—SNI、L—SNI和H—SNI組術后機械性痛閾均降低，差異有顯著性意義(P<0.05)。其中，L—SNI組痛閾低于N—SNI組(P<0.05)，而H—SNI組痛閾高于N—SNI組(P<0.05)。 7、鋅對SNI模型脊髓背側角和DRG中CGRP和NPY

13、的影響 免疫組織化學結果顯示：CGRP和NPY陽性產物為棕褐色細顆粒狀。主要分布在術側的脊髓背側角淺層和DRG神經元細胞質中。與SHAM組相比，N—SNI、L—SNI和H—SNI組的陽性表達均顯著增高(P<0.05)。其中，L—SNI組的陽性表達高于N—SNI組(P<0.05)，而H—SNI組的陽性表達低于N—SNI組(P<0.05)。 8、鋅對SNI模型脊髓背側角神經元凋亡的影響 免疫組織化學檢測結果表明：Ca

14、spases—3、Fas和FasL陽性產物為棕黃色顆粒狀，主要分布在脊髓背側角淺層的神經元中。與SHAM組相比，N—SNI、L—SNI和H—SNI組術側脊髓背側角Caspases—3、Fas和FasL陽性表達均增高(P<0.01)。L—SNI組的表達高于N—SNI組(P<0.01)；H—SNI組的表達低于N—SNI組(P<0.01)。 Westein blot檢測結果表明：與SHAM組相比，N—SNI、L—SNI和H—SNI組

15、術側脊髓背側角Caspases—3、Fas、FasL的陽性表達均顯著增高(P<0.01)。與N—SNI組相比，L—SNI組的陽性表達增多(P<0.01)；H—SNI組的陽性表達減少(P<0.01)。 9、鋅對SNI模型脊髓背側角GFAP表達的影響 免疫熒光染色結果顯示，星形膠質酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)陽性細胞呈綠色熒光，細胞多突起，胞體較小。SHAM組術側脊髓背

16、側角只有少量GFAP陽性細胞。與SHAM組相比較，N—SNI、L—SNI和H—SNI組術側脊髓背側角的GFAP陽性細胞均增多(P<0.05)。與N—SNI組相比，L—SNI組的陽性細胞增多(P<0.05)，H—SNI組陽性細胞減少(P<0.05)。 結論： 1、正常小鼠脊髓和DRG中富含游離鋅離子和ZNT7。其中，ZNT7與高爾基復合體標記物TGN38的表達存在共區(qū)域性。 2、低鋅預處理能使SNI模型脊髓背側角淺