抗人EpCAM單鏈抗體的制備及其應用研究.pdf

1、上皮細胞黏附分子(Epithelialcelladhesionmolecule，EpCAM)是一種I型跨膜蛋白，分子量約為40kDa，在第八屆人類白細胞分化抗原專題會議中，被命名為CD326。EpCAM的胞膜外區(qū)和胞漿區(qū)都具有重要功能。胞膜外區(qū)主要發(fā)揮黏附作用，參與細胞的增殖和遷移。其胞漿區(qū)可以作為信號轉(zhuǎn)導分子，調(diào)節(jié)正?；蚰[瘤細胞中細胞周期蛋白的生成，從而發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導作用。在正常情況下，人EpCAM僅表達于上皮組織；而在病理情況下，Ep

2、CAM在多種腫瘤和炎癥相關組織中表達。無論在胚胎發(fā)育和分化過程中，還是在正常情況下以及炎癥和腫瘤等病理條件下，EpCAM表達都會發(fā)生動態(tài)的變化。EpCAM表達的變化不但對腫瘤細胞增殖、分化等功能起著重要的作用，而且對不同腫瘤具有不同意義，其高表達會導致某些腫瘤的惡性程度增強，在另一些腫瘤中作用則可能相反。此外，EpCAM可以作為胚胎干細胞和某些實體腫瘤干細胞的表面標志物之一。根據(jù)不同的表達情況，EpCAM可能成為某些腫瘤診斷及判斷預后的

3、標志物。EpCAM作為靶點在抗腫瘤治療中一直受到重視。隨著分子生物學和免疫學技術的不斷發(fā)展，針對EpCAM的腫瘤靶向治療方案不斷更新，從上世紀80年代最早應用于臨床的鼠源性單抗，已發(fā)展到目前的單鏈抗體、嵌合抗體和完全人源抗體。其中，2009年Catumaxomab已經(jīng)在歐洲通過臨床試驗和審查，開始用于臨床腫瘤疾病的治療。目前國內(nèi)尚未見有EpCAM的治療性抗體的相關研究。
　　本文主要以EpCAM基因工程抗體的制備和應用為主要研究內(nèi)

4、容。首先，我們從抗EpCAM抗體中，篩選出5株（FMU-EpCAM-2A9、4E4、4A11、2D7和4F6）可與天然EpCAM分子結合的抗體作為構建基因工程抗體的侯選親本抗體。從其中4株雜交瘤細胞系中，成功克隆出單抗FMU-EpCAM-2A9、4E4、2D7和4F6的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因。選擇單抗FMU-EpCAM-2A9的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因為模板，構建了單鏈抗體原核表達載體GST-scFv2A9，表達并純化了GST-scFv2A9

5、融合蛋白。采用流式細胞術、ELISA等方法證實了該融合蛋白具有與天然EpCAM分子以及原核重組表達的EpCAM分子結合的活性。在此基礎上，構建了免疫毒素原核表達載體即單鏈抗體(GST-scFv2A9)-綠膿桿菌外毒素PE(PE38KDLE)，簡寫為GST-scFv2A9-PE或GST-APE；表達、純化了免疫毒素融合蛋白GST-APE，切除GST標簽，進一步證實免疫毒素APE不僅可與天然EpCAM分子以及原核重組表達EpCAM分子相結合

6、，而且可在體外發(fā)揮殺傷表達EpCAM分子的肝癌細胞系HHCC細胞的作用。至此，我們采用分子生物學及免疫學方法制備并鑒定了針對EpCAM的基因工程抗體，為開發(fā)出具有我國自主知識產(chǎn)權的針對EpCAM的治療性抗體打下重要的基礎。
　　此外，本研究分析了EpCAM分子的胞漿區(qū)Ep-ICD和胞膜區(qū)的EpEx，在不同組織學分型的胰腺癌組織中的表達分布規(guī)律。首次發(fā)現(xiàn)在胰腺癌中EpCAM表達與腫瘤的組織學分型有關。預后較差的低分化程度的腫瘤組織胞