UVB誘導細胞損傷機制及紅景天苷保護作用的初步研究.pdf

1、背景：
　　 近年皮膚癌，特別是鱗狀細胞癌的發(fā)生率明顯上升，并呈年輕化趨勢，據(jù)報道90％的皮膚癌與紫外線照射損傷有關。過量的紫外線照射可導致皮膚灼傷、曬黑及免疫抑制，長期作用還可以引起皮膚光老化，并誘發(fā)皮膚癌。
　　 紫外線輻射按波長不同分為UVA(315～400nm)、UVB(280～315nm)和UVC(100～280nm)。太陽輻射通過大氣層時所有的UVC和大約90％的UVB能被臭氧、水汽、氧和二氧化碳吸收，UVA

2、則較少受到大氣的影響，因此，到達地面的紫外線主要是UVA和少量UVB。但是UVB的生物學效應強度是UVA的1000～10000倍，是引起皮膚光老化的主要誘發(fā)因素。同時，地球上方的臭氧層對紫外線的吸收作用急劇下降的區(qū)域，為310nm～315nm的范圍內(nèi)，即UVB的波長范圍。近年來由于地球上方臭氧空洞的形成及增大，致使大氣層對UVB的吸收減弱，并進一步導致到達地球表面的UVB的量迅速增加，因此UVB對生物體損傷的機制及其防護的研究具有理論和

3、實際意義。當UVB引起的損傷發(fā)生于原癌和或抑癌基因時，將可能導致表皮細胞異常增生，甚至發(fā)生癌變。但目前臨床治療皮膚癌的方法有限，尋找一種新的有效的防治皮膚癌的天然藥物就成為當前亟待解決的課題之一。
　　 紅景天具有提高機體免疫力、增強體質、改善人體造血機能、抗缺氧、抗衰老、抗腫瘤、抗疲勞、降血糖、抗病毒、抗輻射、預防高原反應等多種功能。有研究發(fā)現(xiàn)UV照射后，紅景天能夠增強皮膚角質化細胞的抗氧化能力，具有一定的修復和光保護作用。<

4、br>　　 UVB誘導的皮膚腫瘤的發(fā)生是一個復雜的連續(xù)過程，包括一系列基因如原癌基因、抑癌基因的遺傳改變，其中，UVB誘導的腫瘤抑制基因p53的突變被認為是一個早期步驟。p53基因在體內(nèi)充當“基因衛(wèi)士”的角色，可以依靠對其下游因子的激活或抑制來調(diào)節(jié)細胞的生長與凋亡，具有誘導細胞周期組滯、DNA修復和促進細胞凋亡的作用，從而避免受損的DNA堆積、維持基因組的穩(wěn)定性，以及調(diào)節(jié)細胞的分化與衰老，在細胞周期中具有重要的調(diào)節(jié)作用。已有文獻報道，

5、14-3-3σ位于p53的下游，受p53表達的調(diào)節(jié)，并在細胞的突變、細胞周期阻滯中發(fā)揮了重要作用。各種損傷因子引起的DNA損傷可激活p53去磷酸化，并結合在14-3-3σ轉錄起始位點上游1.8kb處的啟動子，隨后激活和升高14-3-3σ的表達，從而阻止細胞進入分裂期，以便進行DNA修復。另外，14-3-3σ也可以反饋調(diào)節(jié)p53的表達，穩(wěn)定并且提高p53的轉錄活性，因此，在p53和14-3-3σ可能存在一個正反饋調(diào)節(jié)環(huán)以維持其功能。在癌組

6、織中，突變的p53導致14-3-3σ表達降低，因此14-3-3σ不能形成G2阻滯，使得突變發(fā)生和染色體結構異常。
　　 目的：
　　 目前為止，關于紅景天抗輻射、抗腫瘤作用的研究相對來說還是很少，而且對人體皮膚腫瘤的作用尚未見報道。本文以人體表皮正常細胞即HaCaT細胞、14-3-3σ高表達的HaCaT細胞及低表達的HaCaT細胞和鱗狀細胞癌細胞即A431細胞為研究對象，研究了HaCaT細胞和A431細胞在UVB照射后存

7、活率的差異，及紅景天苷對UVB誘導的人體表皮正常細胞即HaCaT細胞、14-3-3σ高表達的HaCaT細胞及其低表達的HaCaT細胞和鱗狀細胞癌細胞即A431細胞的保護作用進行了初步探討。
　　 方法：
　　 1、細胞培養(yǎng)
　　 HaCaT細胞和A431細胞分別用含10％小牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng);14-3-3σ高表達、低表達的HaCaT細胞分別用含10％小牛血清

8、、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素、100μg/mlG418的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5％CO2、37℃，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　 2、紫外光光源上海顧村光電儀器廠生產(chǎn)，并經(jīng)上海市計量局檢測，其發(fā)射的紫外線波峰為305nm，當光源距樣品垂直距離為40cm時的功率密度為16.5μW/cm2。
　　 3、HaCaT細胞和A431細胞在不同劑量UVB作用后的存活率取對數(shù)期生長的HaCaT細胞和A431

9、細胞用0.25％胰蛋白酶消化后計數(shù)，HaCaT細胞調(diào)整細胞密度為8～10×104/ml，A431細胞調(diào)整細胞密度為4×104/ml左右，并分別接種于96孔板，并于接種后12～24h，棄去原培養(yǎng)液，用100μlPBS清洗兩次，再加80μlPBS覆蓋細胞后在距UVB光源40cm處用不同劑量(0、5、10、15、20、25J/m2)的UVB分別照射兩種細胞，并繼續(xù)培養(yǎng)20h，MTT法檢測細胞的存活率。
　　 4、HaCaT細胞和A43

10、1細胞在加入不同劑量的紅景天苷后的存活率取對數(shù)期生長的HaCaT細胞和A431細胞用0.25％胰蛋白酶消化后計數(shù)，HaCaT細胞調(diào)整細胞密度為8～10×104/ml，A431細胞調(diào)整細胞密度為4×104/ml左右，并分別接種于96孔板，并于接種后12～24h，棄去原培養(yǎng)基，用100μlPBS清洗兩次，再分別加入含有0、10、20、40、60和80μg/ml紅景天苷的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)20h，MTT法檢測細胞的存活率。
　　 5、25

11、J/m2的UVB照射HaCaT細胞和A431細胞后再加入不同劑量的紅景天苷后的存活率取對數(shù)期生長的HaCaT細胞和A431細胞用0.25％胰蛋白酶消化后計數(shù)，HaCaT細胞調(diào)整細胞密度為8～10×104/ml，A431細胞調(diào)整細胞密度為4×104/ml左右，并分別接種于96孔板，并于接種后12～24h，棄去原培養(yǎng)基，用100μlPBS清洗兩次，再加80μlPBS覆蓋細胞后在距UVB光源40cm處用25J/m2的UVB分別照射兩種細胞，同

12、時設陰性對照組，并于照射后分別加入含有0、10、20、40、60和80μg/ml紅景天苷的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)20h，兩種細胞均以未受照組作為對照。MTT法檢測細胞的存活率。
　　 6、流式細胞術檢測細胞周期分布在UVB照射前及照后12h、18h、24h收集HaCaT細胞并計數(shù)使細胞數(shù)大于1×106個，1000rpm離心3 min后用預冷PBS洗滌細胞2次。加入預冷的70％乙醇，于4℃固定過夜。固定好的細胞1000rpm離心3min，

13、1 ml預冷的PBS洗滌細胞2次，500μlPBS重懸細胞并分別加入PI和RNases A，37℃避光孵育30 min后流式細胞儀進行檢測。
　　 7、Western blot檢測細胞p53，14-3-3σ蛋白表達的變化在UVB照前、照后1h、2h、4h、8h、12h收集HaCaT細胞，用全蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，提取的細胞總蛋白定量后進行SDS-PAGE電泳（10％分離膠和4％濃縮膠），轉膜、5％脫脂奶粉封閉、一抗室溫孵

14、育2h、TBST漂洗、二抗室溫孵育2h、TBST漂洗后進行化學發(fā)光反應后進行顯影、定影。
　　 8、用PT-PCR和Western blot法，分別從RNA水平和蛋白水平檢測不同種類細胞14-3-3σ表達效果。
　　 9、30J/m2的UVB分別照射HaCaT細胞、14-3-3σ高表達的HaCaT細胞及其低表達的HaCaT細胞和A431細胞后再加入不同劑量的紅景天苷后的存活率取對數(shù)期生長的HaCaT細胞、14-3-3σ高

15、表達和低表達的HaCaT細胞及A431細胞用0.25％胰蛋白酶消化后計數(shù)，14-3-3σ高表達和正常的HaCaT細胞調(diào)整細胞密度為8～10×104/ml，14-3-3σ低表達的HaCaT細胞調(diào)整細胞密度為1.2～1.3×105個/ml，A431細胞調(diào)整細胞密度為4×104/ml左右，并分別接種于96孔板，并于接種后12～24h，棄去原培養(yǎng)基，用100μlPBS清洗兩次，再加80μlPBS覆蓋細胞后在距UVB光源40cm處用30J/m2的

16、UVB分別照射兩種細胞，同時設陰性對照組，并于照射后分別加入含有0、10、20、40、60和80μg/ml紅景天苷的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)20h，四種細胞均以未受照組作為對照。MTT法檢測細胞的存活率。
　　 10、統(tǒng)計學分析實驗結果以均數(shù)±標準差（(X)±S）表示，數(shù)據(jù)處理采用SPSS13.0軟件，同種細胞各組間細胞存活率采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，多重比較采用SNK法(Student-Neuman-Keuls)

17、分析，行雙側檢驗，檢驗水準為P＜0.05。
　　 結果：
　　 1、不同劑量的UVB照射HaCaT細胞和A431細胞后細胞的存活率均呈下降趨勢。與對照組相比，HaCaT細胞的存活率的改變從UVB照射15J/m2時有顯著差異(P＜0.05); A431細胞的存活率的改變從UVB照射5J/m2時有顯著差異(P＜0.05)，說明UVB對細胞有殺傷作用。
　　 2、不同劑量的紅景天苷孵育20h后HaCaT細胞的存活率呈先

18、上升后下降的趨勢，但無顯著差異(P＞0.05);而A431細胞的存活率則呈逐漸下降的趨勢，且從紅景天苷的劑量為40μg/ml時差異顯著(P＜0.05)，說明紅景天苷對正常皮膚細胞可能有保護作用而對癌細胞有殺傷作用。
　　 3、25J/m2照射后，加入不同劑量的紅景天苷使HaCaT細胞的存活率呈先上升后下降的趨勢，且在紅景天苷的劑量為10、60和80μg/ml時差異顯著(P＜0.05);而A431細胞的存活率呈逐漸下降的趨勢，且從

19、紅景天苷的劑量為40μg/ml時差異顯著(P＜0.05)，說明紅景天苷對正常皮膚細胞在低劑量時有保護作用、高劑量時有殺傷作用，而對癌細胞有殺傷作用。
　　 4、HaCaT細胞在接受30mJ/cm2的UVB照射后，在照后18h發(fā)生了較明顯的G2/M期阻滯。
　　 5、UVB照射后，HaCaT細胞的p53蛋白，磷酸化的p53蛋白的表達量在照后1h出現(xiàn)升高，于照后12h，磷酸化的p53表達水平開始下降，但仍高于對照組;14-3

20、-3σ蛋白在照后1h也逐漸升高，至12h仍未見下降。
　　 6、14-3-3σ蛋白過表達的細胞株和HaCat細胞株相比，14-3-3σ的表達明顯升高，而穩(wěn)定轉染株和HaCaT細胞株相比，14-3-3σ的表達明顯降低。
　　 7、不同種類的細胞在UVB照射后單獨UVB處理組細胞的存活率明顯低于未處理組，且差異顯著(P＜0.05)，說明UVB對細胞有殺傷作用。但是14-3-3σ高表達、低表達和正常的HaCaT細胞在UVB照射

21、后單獨UVB處理組細胞的存活率存在明顯差異，說明14-3-3σ蛋白在UVB輻射中發(fā)揮了作用。在UVB處理后，HaCaT14-3-3σ-/-和A431細胞隨著紅景天苷劑量的增加，細胞存活率呈下降趨勢，且從紅景天苷劑量為20μg/ml時與UVB處理組相比差異顯著(P＜0.05)，說明紅景天苷聯(lián)合UVB對癌細胞有殺傷作用;而HaCaT14-3-3σ+/+和正常的HaCaT細胞隨著紅景天苷劑量的增加，細胞存活率呈先上升后下降的趨勢，HaCaT1

22、4-3-3σ+/+細胞在紅景天苷劑量為40μg/ml時與UVB處理組相比差異顯著(P＜0.05)，而HaCaT細胞隨紅景天苷劑量的增加細胞存活率的增加無顯著差異(P＞0.05)，說明紅景天苷對HaCaT細胞可能有保護作用。
　　 結論：
　　 1、不同劑量的UVB照射HaCaT細胞和A431細胞后細胞的存活率均呈下降趨勢，為后續(xù)實驗照射劑量的選擇提供了依據(jù)。UVB誘導后紅景天苷對正常皮膚細胞在低劑量時有保護作用、高劑量時

23、有殺傷作用而對癌細胞有殺傷作用。
　　 2、14-3-3σ蛋白表達量不同的細胞在UVB照射后細胞的存活率存在明顯差異，說明14-3-3σ蛋白在UVB輻射損傷中發(fā)揮了作用。而且14-3-3σ蛋白不同表達的細胞在UVB照射后，紅景天苷對其保護作用與14-3-3σ蛋白的表達量有關，說明UVB照射后紅景天苷經(jīng)由14-3-3σ蛋白發(fā)揮了作用。紅景天苷聯(lián)合UVB對癌細胞的殺傷作用和對正常皮膚細胞的可能保護作用，使之可能成為新的防輻射藥物。<