氨基葡甘露聚糖跨細胞膜轉運的研究.pdf

1、目的：用苯酚一硫酸法定量葡甘露聚糖(glucomannanGM)，確定葡甘露聚糖溶液的百分比濃度。利用超聲波的空化作用促使葡甘露聚糖的羥基與氨水(Ⅻ3)發(fā)生氨解反應以人工合成氨基葡甘露聚糖(aminoglucomannanAGM)并測定其氨基化程度。用熒光胺(fluram)標記氨基葡甘露聚糖并探討標記的最佳反應條件，鑒定反應產物(Fluram-AGM)的熒光光譜特征。用熒光胺示蹤氨基葡甘露聚糖的跨細胞膜轉運，以此探討氨基葡甘露聚糖跨(細

2、胞)膜轉運的能力與機制。 方法：1。定量葡甘露聚糖：取標準葡萄糖配成一系列不同濃度的標準溶液，加入苯酚和濃硫酸，待其和葡萄糖充分反應后在490nm處測定相應的吸光度(Aabsorbance)，以吸光度為縱坐標，標準葡萄糖溶液的濃度為橫坐標，繪制標準曲線，并求標準曲線回歸方程；再配制葡甘露聚糖水溶液，離心并用無水乙醇沉淀，再用蒸餾水復溶、稀釋；然后加入苯酚和濃硫酸，待苯酚和濃硫酸與葡甘露聚糖充分反應后，按測定標準溶液吸光度相同的條

3、件測定其吸光度，再根據(jù)測得的吸光度及標準曲線回歸方程求得稀釋后葡甘露聚糖溶液的濃度。2。制備氨基葡甘露聚糖并測定其氨基化程度：取0．21％葡甘露聚糖溶液20ml，加入2ml氨水，利用超聲波使葡甘露聚糖的羥基發(fā)生氨解反應，制得氨基葡甘露聚糖；取標準氨基半乳糖(aminogalactose)配成一系列標準溶液，加入過量的熒光胺，在反應介質的PH值為8、反應溫度為50℃的條件下使熒光胺和氨基半乳糖反應30分鐘，用熒光分光光度計在最大激發(fā)波長和

4、最大發(fā)射波長處測定反應體系的相對熒光強度，以相對熒光強度為縱坐標，氨基半乳糖的濃度為橫坐標，繪制標準曲線，求得標準曲線回歸方程；再取制備的氨基葡甘露聚糖，加入過量的熒光胺，在與上述條件相同的情況下使兩者充分反應并測定反應體系的相對熒光強度，根據(jù)測得的相對熒光強度及標準曲線回歸方程求得氨基己糖的濃度，進而求得氨基己糖在氨基葡甘露聚糖中的含量。3。用熒光胺標記氨基葡甘露聚糖：在反應介質的PH值為7、反應溫度為50℃的條件下使熒光胺和氨基葡甘

5、露聚糖反應30分鐘，用熒光分光光度計測定反應產物(Fluram—AGM)的吸收光譜及發(fā)射光譜；再使熒光胺和氨基葡甘露聚糖在不同的條件(反應時間、溫度、介質的PH值及熒光胺和氨基葡甘露聚糖的克分子比)下反應，用熒光分光光度計在最大激發(fā)波長和最大發(fā)射波長處測定反應體系的相對熒光強度，得出標記的最佳反應條件。4。熒光胺示蹤氨基葡甘露聚糖的跨細胞膜轉運：用熒光胺標記氨基葡甘露聚糖，將標記所得的熒光衍生物與外周血單個核細胞(peripheralb

6、loodmononuclearcellsPBMC)和HepG2細胞在C02培養(yǎng)箱中孵育，然后用熒光顯微鏡(紫光作激發(fā)光)觀察細胞。 結果：1。葡甘露聚糖的濃度是0．2l％。2。氨基葡甘露聚糖的氨基化程度是11．2％。3。熒光胺與氨基葡甘露聚糖的最佳反應條件是反應介質(緩沖溶液)的PH值在6．4—8之間；反應時間是30分鐘；反應溫度是50~C，氨基葡甘露聚糖與熒光胺的克分子比是1：1000。Fluram-AGM的最大激發(fā)波長385