MONCPT對膀胱癌細胞5637的抗腫瘤作用及其機制研究.pdf

1、膀胱癌是我國泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，90％以上為移行細胞癌。初次就診的患者中70％～80％為淺表性膀胱癌，其中70％為Ta期，30％為T1期，不論腫瘤分化程度的高低，都未侵及膀胱肌層。經(jīng)尿道切除術(shù)或者膀胱部分切除術(shù)可以切除原發(fā)腫瘤，但由于膀胱癌的多中心性和多發(fā)性特點，術(shù)后5年復發(fā)率高達三分之二，而術(shù)后15年的復發(fā)率則高達88％，復發(fā)的患者中約有15％會進展為浸潤性膀胱癌。因此，淺表性膀胱癌手術(shù)后如何預防復發(fā)和疾病進展是泌尿外科醫(yī)生共同

2、努力的目標。自上個世紀60年代起開始的膀胱內(nèi)灌注治療有效地延緩或者阻止了腫瘤的復發(fā)和進展，因此，膀胱灌注治療己成為膀胱癌治療的重要手段之一。目前膀胱灌注治療的藥物主要為兩大類，分別為化學藥物和免疫制劑，其中喜樹堿類衍生物是膀胱灌注化療的重要藥物之一。 喜樹堿類衍生物的構(gòu)效關(guān)系分析表明在7，9，10位被基團取代的喜樹堿類衍生物具有很強的抗腫瘤活性。盡管在10位被羥基和烷基取代后，如10-甲氧基喜樹堿有一定的抗腫瘤活性，但是其有較強

3、的毒副作用限制了它的臨床應(yīng)用。相反在9位引入硝基，如9-硝基喜樹堿，不僅能保證其治療效果，同時還具有較低的毒副作用。但要將喜樹堿硝化得到9-硝基喜樹堿是比較困難的，因為12-硝基喜樹堿會是最主要的產(chǎn)物。而對10-羥基喜樹堿進行硝化則容易得到10-甲氧基-9-硝基喜樹堿(MONCPT)，國內(nèi)華東師范大學合成了該化合物。該藥系我國有自主知識產(chǎn)權(quán)的喜樹堿類抗腫瘤新藥，目前正在進行臨床前研究。膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤，本課題就是考察MONC

4、PT對膀胱癌細胞增殖的抑制作用并對其作用機制進行研究。 目的： 1、研究MONCPT對膀胱癌5637細胞增殖的抑制作用(在體和離體)； 2、考察MONCPT對膀胱癌5637細胞周期的影響，若有影響則進一步探討其作用機制； 方法： 1)采用MTT法，評價MONCPT體外抑制膀胱癌5637細胞活性； 2)采用裸小鼠皮下移植瘤模型，觀察MONCPT對荷人膀胱癌5637裸小鼠的實驗治療作用；

5、 3)應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測不同濃度MONCPT和MONCPT在不同作用時間對5637細胞周期的影響； 4)采用Western blotting的方法檢測MONCPT對5637細胞p53，CDK7，p21，AKT，Mat1，Wee1，Cyclin B1，CDK1，Cyclin H，Cdc25C等蛋白表達水平的影響； 結(jié)果： 1、MONCPT對人膀胱癌細胞株的體外抑制作用： 采用MTT法對人膀胱癌5637細胞

6、進行體外IC50測定，結(jié)果表明，MONCPT對人膀胱癌56372胞作用48小時有較強的抑制增殖作用，IC50值為1.31±0.16 μM。結(jié)果還顯示，隨濃度的下降，MONCPT在體外對人膀胱癌5637細胞的抑制率迅速降低，呈明顯的劑量依賴關(guān)系。 2、MONCPT對人膀胱癌5637細胞的實驗治療作用： 對裸小鼠體內(nèi)5637腫瘤的實驗治療作用試驗結(jié)果顯示，MONCPT 5、10和20mg/kg組裸小鼠體重無明顯影響(P>0.

7、05)。與相應(yīng)的溶劑對照組比較，Irinotican10 mg/kg和MONCPT 10 mg/kg組移植瘤體積從第5天開始顯著減小(P<0.05-0.01)，而MONCPT 20 mg/kg組植瘤體積從第3天開始顯著減小(P<0.05)，MONCPT 5 mg/kg組植瘤體積從第9天開始顯著減小(P<0.01)。MONCPT 5 mg/kg組在給藥后第3、5、7、9、11、13和15天的相對腫瘤增殖率(T/C，％)分別為103.2％、

8、84.6％、95.7％、80.2％、62.0％、41.6％和23.8％，從第13天開始相對腫瘤增殖率小于60％；MONCPT 10 mg/kg組相應(yīng)的相對腫瘤增殖率分別為95.3％、67.7％、61.4％、34.2％、21.2％、11.1％和6.2％，從給藥后第9天開始相對腫瘤增殖率小于60％；MONCPT 20 mg/kg組相應(yīng)的相對腫瘤增殖率分別為73.2％、51.9％、40.3％、20.9％、11.7％、6.9％和3.3％，從給藥

9、后第5天開始相對腫瘤增殖率小于60％；Irinotican 10.0 mg/kg組相應(yīng)的相對腫瘤增殖率分別為88.1％、70.4％、50.5％、31.3％、20.8％、13.8％和7.3％，從給藥后第7天開始相對腫瘤增殖率小于60％。給藥15天后剖殺裸小鼠取瘤塊稱重發(fā)現(xiàn)，MONCPT 5 mg/kg、10 mg/kg和20mg/kg組的人膀胱癌5637移植瘤平均重量分別為0.63±0.12g、0.24±0.06 g和0.06±0.03

10、g，與陰性對照組的1.83±0.30 g比較均有明顯下降(P<0.01)，三個劑量組相應(yīng)的腫瘤抑制率分別為64.8％、86.2％和96.5％，腫瘤抑制率均大于40％。Irinotican 10.0 mg/kg組的平均瘤重為0.36±0.09 g，與溶劑對照組比較也有顯著下降(P<0.01)，抑瘤率為81.1％，大于40％。 3、MONCPT誘導人膀胱癌5637細胞周期阻滯作用： MONCPT10，1，0.1，0.01μM分別對人

11、膀胱癌5637細胞作用24小時后，DNA分析結(jié)果表明，溶劑對照組的G2/M期的腫瘤細胞百分率分別為8.56±2.13％；而MONCPT10，1，0.1，0.01μM處理24小時后，處于G2/M期腫瘤細胞百分率分別為19.7±3.6％、46.9±7.3％、76.8±9.2％和18.55±3.5％，0.1μM的MONCPT能達到最大的腫瘤細胞周期阻滯作用。用0.1μM的MONCPT處理5637細胞12h，24h，36h和48h，并設(shè)溶劑對照

12、，收集各組細胞，用流式細胞術(shù)檢測細胞的周期阻滯率。結(jié)果顯示，溶劑對照組的G2/M期的腫瘤細胞百分率為11.45±2.3％，隨著MONCPT作用時間的延長，G2/M期比率分別為22.4±3.85％(12h)、79.18±7.3％(24h)、50.15±6.25％(36h)和29.7±3.85％(48h)。 4、MONCPT對5637細胞周期相關(guān)蛋白表達量的影響： 用0.1μM MONCPT分別處理5637細胞12，24，3

13、6和48h，并設(shè)對照，收集各組細胞，提取蛋白，用Western印跡法檢測CDK1、CyclinB1、Cyclin H、MAT1、AKT、Wee1、CDK7，Cdc25C，p21和p53蛋白表達量的變化。結(jié)果顯示，隨給藥時間的延長，MONCPT可使人膀胱癌5637細胞p53，p21的表達先增加后下降，MAT1、CyclinB1的表達先下降后增加，CDK1、CDK7、Cdc25C、Cyclin H、AKT、Wee1的表達量下降。 討

14、論和結(jié)論： MONCPT是新合成的喜樹堿類衍生物。體內(nèi)外的抗腫瘤實驗證實MONCPT對人膀胱癌5637細胞具有很強的抑制增殖作用，同時我們還證實這種作用是可以通過對細胞周期G2/M期阻滯實現(xiàn)的。 近幾年來，植物來源的抗腫瘤藥物受到了廣泛的關(guān)注。當哺乳動物細胞遇到DNA損傷時，細胞周期會停滯直到錯誤被糾正，細胞周期G2/M期被阻滯后細胞將停滯生長。相比較G1/S，人們對G2/M了解的并不多，然而這個周期檢驗點對于腫瘤發(fā)生卻

15、是非常重要的。G2/M的轉(zhuǎn)變是受到Cdc家族蛋白和cyclin調(diào)控的，Cdc2可以被四個轉(zhuǎn)錄靶點p53，Gadd45，p21和14-3-3 σ所抑制。 p53可作為轉(zhuǎn)錄因子，誘導另外幾種蛋白的產(chǎn)生，如p21，從而達到調(diào)控細胞周期的作用。在哺乳動物細胞中，cyclin的結(jié)合和CAK對Cdc2的Thr161位磷酸化對于Cdc2-cyclin B復合物的活性都是非常重要的。若沒有Cdc25C對Cdc2的Thr14和Tyr15位去磷酸化

16、，且Plk1磷酸化cyclin B時，細胞周期將被停滯。 當用0.1 μM MONCPT分別處理5637細胞12，24，36和48h，Western印跡法檢測結(jié)果顯示，隨給藥時間的延長，5637細胞的p53，p21表達先增加后下降，MAT1、CyclinB1表達先下降后增加，CDK1、CDK7、Cdc25C、Cyclin H、AKT、Wee1表達量下降。因此，我們推測，MONCPT使人膀胱癌5637細胞終止在G2/M期的作用可能

17、是其通過誘導細胞p53、p21表達上調(diào)和CyclinB1、CDK1、CDK7、AKT、Wee1、Cyclin H、Mat1和Cdc25C表達下調(diào)，從而使細胞終止在G2/M期，達到抑制腫瘤細胞增殖的作用。綜上所述，我們實驗證實，MONCPT對人膀胱癌5637細胞的增殖具有明顯的抑制作用，其作用機制可能與p53通路、CDK7、Cdc25C及cyclin B1-CDK1復合物有密切關(guān)系，通過阻滯膀胱癌細胞周期而發(fā)揮抗腫瘤活性。在體和離體實驗證