登革病毒非編碼3’亞基因組RNA的鑒定與功能分析.pdf

1、登革病毒(dengue virus,DV)是重要的蟲媒黃病毒(Flavivirus),能引起人類的登革熱和登革出血熱。目前尚無有效的登革疫苗和抗病毒藥物。登革病毒基因組為一條單股正鏈RNA分子,可作為信使RNA直接起始翻譯,并通過其中僅有的一條長讀碼框(open reading frame,ORF)編碼病毒所有的十種特異蛋白。病毒基因組RNA(genomic RNA,gRNA)亦可作為模板指導子代gRNA的合成,該過程遵循“gRNA——

2、gRNA互補負鏈——子代gRNA”的模式。由此可見,登革病毒基因組的表達和復制都圍繞著一條gRNA分子進行。因而通常認為登革病毒并不產(chǎn)生亞基因組RNA分子(sub-genomic RNA,sgRNA)。
　　登革病毒基因組的表達和復制受一系列基因組順式作用元件(cis-acting element)和反式激活因子(trans-activator)的調控。登革病毒的順式調控元件主要位于gRNA5’和3’端上的非編碼區(qū)(non-cod

3、ing region),其中包含了多個高度保守的RNA二級結構。這些RNA結構元件能夠特異性地識別病毒復制的反式激活因子,從而對病毒gRNA的翻譯和復制過程進行調控。根據(jù)病毒基因組結構特征,通常認為,5’NCR的功能與gRNA的翻譯有關。而3’NCR負責調控gRNA的復制。通過前期的研究,我們發(fā)現(xiàn)3’NCR中還存在翻譯增強元件(Translation enhancement element,TE)。囿于現(xiàn)有的登革病毒復制模型,還不能完滿

4、地解釋上述矛盾,推測在病毒基因組的復制過程中還存在其它調控機制。
　　從進化上看,單正鏈RNA病毒的基因組結構特征與其采取的基因組復制調控策略存在密切的關系。值得注意是,一些單正鏈的RNA病毒雖然在基因組結構上與登革病毒近似,但在復制上還需要產(chǎn)生源于病毒基因組3’末端的亞基因組RNA分子(3’sub-genomic RNA,3’sgRNA)。利用這類3’sgRNA分子,病毒既可增強基因組3’末端基因的表達,或進一步對自身復制進行調

5、控。但對登革病毒,目前尚無相關的研究。因此,倘若登革病毒在復制過程中確實存在類似的3’sgRNA分子,這無疑對闡明登革病毒復制調控策略具有重要的意義,并為研究登革病毒復制的分子機制提供新的思路。
　　為此,本研究通過Northern雜交方法對登革病毒感染的細胞和組織總RNA進行了鑒定。首先根據(jù)登革四個血清型病毒基因組3’NCR序列比對結果,選定基因組3’最末端的高度保守序列作為雜交探針的靶點,利用體外轉錄方法制備獲得地高辛標記的探

6、針RNA分子。初步的雜交結果證實登革病毒在復制過程中確能產(chǎn)生一類源于基因組3’末端的亞基因組RNA分子(3’sgRNA)。進一步的雜交結果表明,從登革四個血清型病毒所感染的BHK-21細胞與乳鼠腦組織中均可檢出該類3’sgRNA分子,表明它的產(chǎn)生是登革病毒復制中的普遍現(xiàn)象。同時還觀察到登革2型中的一株病毒(DV2-43)能同時產(chǎn)生三條3’sgRNA分子的株特異性現(xiàn)象。在病毒感染后的不同時間點上,隨著病毒gRNA復制增多,3’sgRNA在

7、宿主細胞中也不斷累積。這一現(xiàn)象提示3’sgRNA的產(chǎn)生很可能與病毒復制有關。此外,在不同組織來源的宿主細胞中,病毒3’sgRNA的生成量存在明顯的差異。這提示了3’sgRNA的產(chǎn)生還與宿主因素存在某種關聯(lián)。上述結果為闡明登革病毒3’sgRNA的產(chǎn)生機制和潛在的生物學功能提供了重要的線索。
　　在此基礎上,為明確登革病毒3’sgRNA產(chǎn)生的緣由,本研究利用5’RACE法獲得了登革病毒3’sgRNA的序列信息。比對結果顯示登革病毒3’

8、sgRNA的5’端起始于病毒基因組3’NCR的內部,這表明3’sgRNA實質上是游離形式的3’NCR分子。3’sgRNA的5’起始序列高度保守,且能形成一個穩(wěn)定的RNA莖環(huán)結構SL,提示該段序列可能具有啟動子樣功能。RNA結構預測還表明,保守序列與SL結構的莖部序列恰好吻合,說明3’sgRNA的產(chǎn)生與SL結構的形成有關。在細胞5’核酸外切酶XRN-1的作用下,SL結構的存在可使病毒gRNA及其模擬物VIRG分子經(jīng)部分降解產(chǎn)生與3’sgR

9、NA類似的RNA片段。另一方面,Western blotting結果表明,XRN-1可被BHK-21等真核細胞表達。上述結果初步表明 XRN-1參與了登革病毒3’sgRNA在細胞內的生成。我們認為3’sgRNA的產(chǎn)生是RNA結構與宿主核酸酶類相互作用的結果,這為從分子機制上干擾3’sgRNA的產(chǎn)生提供了可能的靶點,并為揭示該分子的生物學功能奠定了基礎。
　　為進一步探明3’sgRNA的生物學功能,本研究通過將3’sgRNA轉染細胞

10、的方法,對3’sgRNA在病毒基因組翻譯和復制中的作用進行的鑒定。我們首先利用病毒小基因組VIRG對登革病毒gRNA的翻譯起始過程進行了模擬,從中觀察到3’sgRNA的轉染能下調VIRG報告基因的表達量。而對病毒基因組RNA的定量分析結果表明,預先轉染3μg的3’sgRNA轉錄體,可使105個細胞中的病毒基因組RNA拷貝數(shù)上升一個數(shù)量級,并且3’sgRNA轉染量與其對復制的增強作用間存在依賴性關系。登革病毒在3’sgRNA轉染的細胞上能

11、形成更多的病毒蝕斑,說明3’sgRNA不僅對gRNA翻譯和復制起調節(jié)作用,它的存在也有利于病毒的增殖。為明確3’sgRNA的作用機制,本研究對3’sgRNA包含的基因組環(huán)化序列進行了突變,以求破壞3’sgRNA與病毒基因組5’端的互補結合。結果表明,突變可削弱3’sgRNA對病毒復制的增強作用,這說明3’sgRNA的調節(jié)作用依賴環(huán)化序列介導的RNA-RNA相互作用。由此我們認為登革病毒3’sgRNA是一種通過反式作用對病毒復制進行調節(jié)的