青藤堿對RANKL和LPS誘導的破骨細胞的影響及作用機制研究.pdf

1、骨代謝的穩(wěn)定需要破骨細胞(OCs)介導的骨吸收和成骨細胞介導的骨形成作用間的動態(tài)平衡和偶聯(lián)，在健康個體中，二者維持功能平衡，而平衡一旦打破則可能導致骨骼疾病的發(fā)生。骨破壞主要是由異常的OCs活化造成的，過度骨破壞可能導致一些常見疾病，如類風濕關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、骨髓炎、牙周炎等。目前對于這些疾病的藥物治療相當有限，主要依賴于糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、抗生素或非甾體抗炎藥，然而這些藥物不能逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)侵蝕，有的甚至有反作用。OCs是體內(nèi)唯一負責骨

2、吸收的細胞，靶向抑制OCs活化被認為是逆轉(zhuǎn)骨破壞最有效、最直接的治療策略，目前已經(jīng)成為該領域的研究熱點。
　　 OCs起源于骨髓單核-巨噬細胞譜系細胞，在體內(nèi)必須依賴于一些誘因誘導分化發(fā)育為多核的成熟OCs。目前認為最直接活化OCs的內(nèi)源性分子是激活核因子NF-κB受體的配體(RANKL)。RANKL通過和OCs膜上受體RANK結(jié)合，募集形成TRAF6和c-Src復合體，激活下游信號通路(NF-κB、MAPK和Ca2+通路)通過

3、胞內(nèi)信號傳導途徑激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、AP-1和NFATc(l)，激活OCs相關基因表達，例如抗酒石酸堿性磷酸酶(TRACP)，金屬基質(zhì)蛋白酶9(MMP-9)，整合素β3（integrinβ3）和組織蛋白酶K(cathepsinK)，促進OCs分化，增強骨吸收活性，抑制其凋亡，最終導致OCs數(shù)量增多、功能亢進。
　　 脂多糖(LPS)被認為是導致慢性G-菌感染骨丟失的最主要介質(zhì)，被認為與誘導OCs活化密切相關，其誘導機制目前

4、認為包括:通過誘導成骨細胞中RANKL的表達來控制OCs的分化和激活;通過刺激巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α，IL-1和IL-6等炎癥因子以及延長OCs的生命周期。
　　 青藤堿是傳統(tǒng)抗風濕中藥青風藤中的主要活性成分。具有明顯抗風濕、抗炎、免疫抑制等藥理作用。其相關制劑在臨床上對各種風濕病具有確切療效。盡管相關研究發(fā)現(xiàn)青藤堿具有降低骨破壞程度的效果，但是否能調(diào)控OCs仍未見有報道。本課題以青藤堿為研究對象，利用體外RANKL和LPS誘導

5、OCs體系及體內(nèi)Mt誘導的佐劑性關節(jié)炎骨破壞模型和LPS誘導的急性顱骨骨破壞模型，探討青藤堿對OCs的調(diào)節(jié)作用及分子機制。主要內(nèi)容包括三部分:1.青藤堿對RANKL誘導的OCs的影響;2.青藤堿對RANKL誘導的OCs的作用機制;3.青藤堿對LPS誘導的RAW-OCL的影響及機制。
　　 實驗方法:
　　 1)通過CellTiter-Glo法和CCK-8法考察不同濃度青藤堿(0.125、0.25、0.5、1mM)干預不同

6、時間(6h、24h、48h、5d)對RAW264.7細胞的生存影響，確定合適的體外用藥濃度。利用體外RANKL誘導RAW264.7細胞形成OCs體系，通過TRACP染色計數(shù)評價青藤堿(0.25、0.5、1mM)對OCs形成和生存的影響;通過骨片吸收實驗對骨凹陷和骨吸收面積統(tǒng)計分析評價青藤堿(0.5、1mM)3天內(nèi)對成熟OCs骨吸收功能的影響;利用標記FITC的鬼筆環(huán)肽染色評價青藤堿(1mM)6h內(nèi)對OCs肌動蛋白環(huán)結(jié)構的影響;采用Rea

7、l-Time PCR技術，檢測青藤堿(0.25、0.5、1 mM)對RANKL誘導的RAW264.7細胞相關基因TRACP，MMP-9，c-Src，Integrinβ3和cathepsin K表達水平的影響。
　　 建立Mt誘導的佐劑性關節(jié)炎SD大鼠骨破壞模型，評價青藤堿(i.p.80mg/kg/day)和陽性藥物雷公藤多甙片(i.g.2.5 mg/kg/day)對模型動物足踝腫脹、骨破壞病理變化、OCs數(shù)量、骨參數(shù)（組織礦物質(zhì)

8、密度、骨礦物質(zhì)密度、骨體積分數(shù)、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量，骨小梁分離度）及血清中相關細胞因子RANKL、骨保護素(osteoprotegerin，OPG)、TRACP5b和堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)水平的影響。
　　 2)考察青藤堿對RANKL相關信號通路的影響，利用體外RANKL誘導RAW264.7細胞體系中，首先采用熒光報告基因技術，檢測青藤堿對核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化的影響;接著通過West

9、ern blot和免疫熒光實驗，檢測青藤堿對NF-κB信號通路相關分子(p65和IκB-α)表達及p65核轉(zhuǎn)位的影響;再通過RT-PCR和Western blot檢測青藤堿對NF-κB上游分子（RANK和TRAF6）表達的影響。接下來通過Western blot和Ca2+探針Fluo-3 AM標記考察了青藤堿對TRAF6下游MAPK信號通路分子(p38、ERK和JNK)磷酸化及200s內(nèi)RANKL誘導OCs的Ca2+濃度變化。最后通過熒

10、光報告基因技術檢測青藤堿對核轉(zhuǎn)錄因子AP-1和NFAT活化的影響;再通過RT-PCR和Western blot檢測青藤堿對AP-1相關分子（c-Fos、Fra-1和Fra-2）和NFATc(l)基因表達及c-Fos蛋白表達的調(diào)控。
　　 考察青藤堿對RANKL誘導的成熟OCs凋亡的影響，首先通過DNA Ladder分析不同濃度(0.25、0.5、1、2mM)青藤堿在不同時間段(12、24、36、48 h)對OCs凋亡的影響;再通

11、過Hochst33258染色評價0.5mM青藤堿在單用或聯(lián)合Caspase-3抑制劑Ac-DEVD-CHO(10μM)時對OCs細胞核凋亡的影響。對于青藤堿誘導成熟OCs凋亡的信號通路，我們通過Western blot和檢測不同濃度(0.25、0.5、1、2mM)青藤堿在不同時間段(12、24、36、48 h)對活化的Caspase-3蛋白表達的影響，并利用Caspase-3酶活性比色法檢測0.5和1mM青藤堿以及陽性對照藥物喜樹堿（4

12、μM）在單用或聯(lián)合Ac-DEVD-CHO(10μM)24h內(nèi)對Caspase-3酶活性的影響。
　　 3)利用體外LPS誘導RAW264.7細胞形成RAW-OCLs體系，通過TRACP染色計數(shù)評價青藤堿(0.25、0.5、1mM)對RAW-OCLs形成和生存的影響;通過骨片吸收實驗對骨凹陷計數(shù)評價青藤堿（0.25、0.5、1mM）對3天內(nèi)對成熟RAW-OCLs骨吸收功能的影響;利用標記FITC的鬼筆環(huán)肽染色評價青藤堿(1mM)6

13、h內(nèi)對RAW-OCLs肌動蛋白環(huán)結(jié)構的影響;利用ELISA檢測青藤堿(0.25、0.5、1 mM) LPS誘導的RAW-OCLs釋放TNF-α的影響;采用Real-TimePCR技術，檢測青藤堿(0.25、0.5、1mM)對LPS誘導的RAW264.7細胞和成熟RAW-OCLs的TRACP, MMP-9，c-Src，Integrinβ3和cathepsin K基因表達影響。建立LPS誘導的C57BL/c小鼠急性顱骨骨破壞模型，通過HE染

14、色和TRACP染色評價青藤堿(i.h.25、50、100 mg/kg/day)對LPS誘導的顱骨破壞和OCs數(shù)量的影響，并通過ELISA檢測血清中TNF-α水平。
　　 考察青藤堿對LSP誘導的RAW-OCLs作用機制，首先采用熒光報告基因技術，檢測青藤堿對LPS誘導的RAW264.7細胞核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化的影響;接著通過Western blot和免疫熒光實驗，檢測青藤堿對LPS誘導的RAW264.7細胞NF-κB信號通路

15、相關分子（p65和IκB-α）表達及p65核轉(zhuǎn)位的影響;再通過RT-PCR檢測青藤堿對LPS誘導的RAW264.7細胞和成熟RAW-OCLs的NF-κB上游分子（TLR4和TRAF6）表達的影響，最后利用和Western blot檢測青藤堿對LPS誘導的RAW264.7細胞TLR4和TRAF6蛋白表達的影響。接下來通過Western blot和Ca2+探針Fluo-3 AM標記考察了青藤堿對LPS誘導的RAW264.7細胞的MAPK信號

16、通路分子(p38、ERK和JNK)磷酸化及200s內(nèi)RAW-OCLs的Ca2+濃度變化。最后通過熒光報告基因技術檢測青藤堿對LPS誘導的RAW264.7細胞核轉(zhuǎn)錄因子AP-1和NFAT活化的影響;再通過RT-PCR檢測青藤堿對LPS誘導的RAW264.7細胞和成熟RAW-OCLs的AP-1相關分子（c-Fos、Fra-1和Fra-2）和NFATc(l)基因表達的調(diào)控并利用Western blot檢測RAW264.7細胞中c-Fos蛋白表

17、達水平。
　　 實驗結(jié)果:
　　 1)細胞生存實驗發(fā)現(xiàn)除1mM青藤堿干預5d后（抑制率約50％，F(xiàn)=10.95，P＜0.01），青藤堿(0-1mM)對RAW264.7細胞5天內(nèi)生存未發(fā)現(xiàn)顯著影響。通過TRACP染色發(fā)現(xiàn)0.25mM、0.5mM和1 mM青藤堿能顯著抑制體外RANKL誘導的OCs形成(F=65.08，P＜0.01)，0.5 mM和1mM青藤堿能顯著抑制OCs生存(F=91.08，P＜0.01);通過骨片吸收

18、實驗發(fā)現(xiàn)0.5 mM和1mM青藤堿3d內(nèi)能顯著降低骨吸收面積(F=59.35，P＜0.01)和骨凹陷(F=24.79，P＜0.01)，提示其抑制成熟OCs骨吸收功能。1mM青藤堿6h內(nèi)能破壞OCs的肌動蛋白環(huán)結(jié)構，顯著減少肌動蛋白環(huán)數(shù)量(t=8.628，P=0.0132)。青藤堿能呈劑量依賴性抑制RANKL誘導的TRACP(F=35.99, P＜0.01),MMP-9(F=63.30, P＜0.01),c-Src(F=21.80, P＜

19、0.01),Integrinβ3(F=6.839，P=0.0134)和cathepsin K(F=5.052，P=0.0298)基因表達，尤其對c-Src，MMP-9，TRACP的表達在0.25 mM時仍具有顯著性差異。80mg/kg/day青藤堿阻斷Mt誘導的關節(jié)炎大鼠足腫脹發(fā)展，降低關節(jié)滑膜部位的炎癥侵潤并顯著降低OCs數(shù)量(F=16.61，P＜0.01)，提高骨密度，顯著升高骨參數(shù)TMD(F=12.34, P＜0.01)、BMD(

20、F=7.066, P＜0.01)、BV/TV(F=13.22,P＜0.01)、Tb.Th(F=18.69, P＜0.01)、Tb.N(F=16.67, P＜0.01)，降低Tb.Sp(F=40.26,P＜0.01)，顯著降低血清中RANKL含量(F=33.58，P＜0.01)，RANKL/OPG比值(F=12.81，P＜0.01)和TRACP酶活力(F=9.789，P＜0.01)，升高OPG含量(F=13.07，P＜0.01)和ALP酶

21、活性(F=38.66，P＜0.01)。
　　 2)機制研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿劑量依賴性抑制RANKL誘導的NF-κB報告基因表達，0.25 mM時仍具有顯著性差異(F=107.9，P＜0.01)。青藤堿通過抑制IκB-α降解和p65入核表達從而抑制RANKL誘導NF-κB信號通路活化，并顯著抑制其上游分子TRAF6基因(F=32.82，P＜0.01)和蛋白表達。青藤堿選擇性抑制RANKL誘導的TRAF6下游分子JNK和p38磷酸化及O

22、Cs的Ca2+內(nèi)流。青藤堿劑量依賴性抑制RANKL誘導的NFAT(F=93.23，P＜0.01)和AP-1(F=25.70，P＜0.01)報告基因表達，0.25 mM時仍具有顯著性差異。0.5和1mM青藤堿均能顯著抑制AP-1相關分子c-Fos(F=14.96，P＜0.01)、Fra-1(F=36.00，P＜0.01)、Fra-2(F=12.71，P＜0.01)和NFATc(l)(F=10.82，P＜0.01)基因表達并抑制c-Fos蛋

23、白表達。
　　 0.5mM青藤堿干預12-48 h和0.25-2 mM青藤堿干預24h均導致RANKL誘導的成熟OCs出現(xiàn)DNA梯狀條帶，其中以0.5 mM作用24 h最為顯著;通過Hochst33258染色也發(fā)現(xiàn)0.5 mM青藤堿干預24h后導致大量OCs細胞核出現(xiàn)典型斷裂，聚集和濃縮，該現(xiàn)象部分被Ac-DEVD-CHO阻斷，提示青藤堿通過激活Caspase-3誘導OCs凋亡。通過Western blot試驗發(fā)現(xiàn)0.5 mM青

24、藤堿干預成熟OCs12-48 h均能誘導活化的Caspase-3亞基表達上升，0.5-2mM青藤堿干預24 h均能誘導活化的Caspase-3亞基表達上升。同時通過比色法發(fā)現(xiàn)0.5 mM和1mM青藤堿均能顯著提高OCs的Caspase-3酶活力(F=54.26，P＜0.01)，但能被Ac-DEVD-CHO完全阻斷。
　　 3)通過TRACP染色發(fā)現(xiàn)0.5 mM和1mM青藤堿能顯著抑制體外LPS誘導的RAW-OCLs形成(F=41

25、.29，P＜0.01)和生存(F=53.74，P＜0.01)。通過骨片吸收實驗發(fā)現(xiàn)0.5 mM和1mM青藤堿3d內(nèi)能顯著RAW-OCLs形成的骨凹陷數(shù)量(F=37.01，P＜0.01)，提示其對于LPS誘導的OCLs的骨吸收活性有抑制作用。1mM青藤堿6h內(nèi)能顯著降低LPS誘導的RAW-OCLs的肌動蛋白環(huán)結(jié)構百分率(t=12.73，P＜0.01)。0.25-1 mM青藤堿能呈劑量依賴性顯著降低LPS誘導的TNF-α釋放(F=38.08

26、，P＜0.01)。1mM青藤堿對LPS誘導的RAW264.7前體細胞的TRACP,(F=20.97, P＜0.01)、MMP-9(F=29.99, P＜0.01)、c-Src(F=21.83,P＜0.01)、Integrinβ3(F=5.363, P=0.0256)和cathepsin K(F=13.13, P＜0.01)均具有顯著抑制作用;0.5mM時除Integrinβ3外，也均具有顯著抑制作用;0.25mM時對c-Src、cath

27、epsin K和MMP-9仍具有顯著抑制作用。對成熟OCLs各相關基因表達，0.5mM和1mM青藤堿對TRACP,(F=418.6，P＜0.01)、MMP-9(F=61.85, P＜0.01)、c-Src(F=387.0, P＜0.01)、Integrinβ3(F=176.9, P＜0.01)和cathepsin K(F=166.0，P＜0.01)均具有顯著抑制作用，尤其對TRACP、c-Src和MMP-9的表達在低濃度(0.25 mM

28、)時仍具有顯著抑制效應。通過組織學圖像分析，100和50 mg/kg青藤堿能顯著降低LPS誘導的小鼠顱骨骨破壞模型的炎癥侵潤面積(F=32.97，P＜0.01)和TRACP+細胞數(shù)量(F=31.48，P＜0.01)，并且25，50，100 mg/kg青藤堿均能顯著降低血清中TNF-α含量(F=31.18，P＜0.01)。
　　 機制研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿劑量依賴性抑制LPS誘導的NF-κB報告基因表達，0.25mM時仍具有顯著性差異(

29、F=150.5，P＜0.01)。青藤堿通過抑制RAW264.7細胞IκB-α降解和p65入核表達從而抑制LPS誘導NF-κB信號通路活化，并呈劑量依賴性抑制其上游分子TLR4(F=9.551，P＜0.01)和TRAF6(F=71.64，P＜0.01)基因和蛋白表達;而對于RAW-OCLs僅抑制TLR4(F=60.60，P＜0.01)的基因表達而未發(fā)現(xiàn)影響TRAF6。青藤堿選擇性抑制LPS誘導RAW264.7細胞的MAPK通路中p38和E

30、RK磷酸化，并抑制RAW-OCLs的Ca2+內(nèi)流，提示其可能影響下游轉(zhuǎn)錄因子AP-1和NFATc(l)。進一步研究發(fā)現(xiàn)青藤堿在0.25-1 mM濃度下顯著抑制LPS誘導的NFAT報告基因表達(F=98.74，P＜0.01);0.5和1mM時能顯著抑制AP-1報告基因表達(F=181.5，P＜0.01)。RT-PCR實驗發(fā)現(xiàn)0.5和1mM青藤堿均能顯著抑制LPS誘導的RAW264.7細胞中AP-1相關分子c-Fos(F=72.34, P＜

31、0.01)、Fra-1(F=28.28, P＜0.01)、Fra-2(F=33.08, P＜0.01)和NFATcl(F=39.98，P＜0.01)基因表達;在RAW-OCLs中0.25-1mM青藤堿對c-Fos(F=685.1, P＜0.01)、Fra-2(F=3015, P＜0.01)和NFATc(l)(F=3033, P＜0.01)表達均具有顯著抑制作用，但對Fra-1未發(fā)現(xiàn)顯著抑制作用。青藤堿呈劑量依賴性抑制LPS誘導的RAW2

32、64.7細胞中c-Fos蛋白表達。
　　 結(jié)論:
　　 1.青藤堿能抑制體外RANKL誘導RAW264.7細胞形成OCs，并抑制其骨吸收功能。
　　 2.青藤堿通過激活Caspase-3誘導OCs凋亡和破壞OCs的肌動蛋白環(huán)結(jié)構，從而抑制OCs生存。
　　 3.青藤堿能抑制Mt誘導的關節(jié)炎大鼠OCs活化，降低骨破壞，提高骨密度。
　　 4.青藤堿通過抑制上游TRAF6，一方面調(diào)控NF-κB信號通路

33、抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化;另一方面通過抑制JNK和p38磷酸化和Ca2+內(nèi)流，抑制核轉(zhuǎn)錄因子AP-1和NFATcl;最終下調(diào)OCs相關基因表達，抑制RANKL誘導的OCs活化。
　　 5.青藤堿能抑制體外LPS誘導的RAW-OCLs形成、生存和骨吸收功能。
　　 6.青藤堿能抑制LPS誘導的小鼠急性顱骨骨破壞模型的OCs活化并降低TNF-α水平。
　　 7.青藤堿通過調(diào)控上游TLR4和TRAF6，影響NF-κ