抑制PAR4表達對腸癌細胞SW620惡性表型的影響.pdf

1、惡性腫瘤是迄今嚴重危害人類健康的重要疾病之一,侵襲和轉移是惡性腫瘤兩個關鍵的生物學行為,也是影響腫瘤患者臨床預后的主要因素,在相當長的時間內惡性腫瘤的侵襲和轉移仍然是人類面臨的亟待解決的重大基礎和臨床問題。腫瘤的侵襲和轉移是一個多步驟多階段的復雜過程,受眾多相關因素的共同影響。在這些相關因素中,各種蛋白酶在腫瘤的侵襲轉移中發(fā)揮著重要的作用。以往人們對蛋白酶的研究主要側重于其降解細胞外基質,從而促進腫瘤細胞的侵襲和轉移,近年的研究表明,蛋

2、白酶還能通過激活各種信號傳導途徑、調控相應的基因表達而參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的整個過程。
　　 蛋白酶對基因表達的調控主要是通過位于細胞膜表面的蛋白酶激活受體(protease-activated receptors,PARs)進行的。PARs是一類帶7個跨膜區(qū)的自身帶有配體的特殊的G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptor,GPCR),其N端經特異性蛋白酶水解后成為自身配體而被活化,并通過與其偶聯的G蛋白酶

3、觸發(fā)一系列信號傳導,進而調控下游相應基因的表達。目前已明確的PARs有4種,其中PAR4(protease-activated receptor4)是近年來發(fā)現的一個亞型,是一個低親和力的凝血酶受體。研究表明,PAR4在乳腺癌、肝癌、腸癌、前列腺癌、軟組織肉瘤、星形細胞瘤等多種惡性腫瘤細胞中表達升高,根據這些情況,可以推測PAR4表達水平與這些惡性腫瘤的生物學行為相關,但PAR4在不同腫瘤細胞中表達升高的原因及其與腫瘤細胞的生長、侵襲轉

4、移等惡性表型的關系,目前的研究均未涉及。
　　 本課題以PAR4作為研究對象,以人腸癌細胞SW620為模型,采用人工microRNA技術對PAR4進行表達抑制,研究抑制PAR4表達對腸癌細胞SW620生長、移及耐藥等惡性表型的影響。具體內容如下:
　　 1.靶向抑制PAR4表達的人工microRNA表達載體的構建:
　　 1.1根據NCBI的GenBank數據庫獲得人PAR4的mRNA序列的資料(登錄號NM_00

5、3950),利用網絡資源(http://cancan.cshl.edu/cgi-bin/Codex/Codex.cgi),選擇合適的人工microRNA序列,通過兩次PCR擴增獲得142 bp的人工microRNA前體片段,克隆至pMD19-T載體上,用BamHⅠ和BglⅡ雙酶切鑒定,并經DNA測序證實。
　　 1.2將經測序證實正確的人工microRNA前體序列進行串聯連接,得到8個串聯連接的人工microRNA前體序列后,以

6、BamHⅠ和BglⅡ雙酶切,亞克隆于經去磷酸化pcDNA3.1(+)的BamHⅠ位點,用BamHⅠ和PvuⅠ酶酶切鑒定轉化子質粒,將正向插入片段的表達載體命名為pcDNA3.1(+)-8×PAR4-ami。
　　 2.PAR4表達抑制對SW620細胞生長運動能力的影響
　　 2.1細胞轉染:
　　 利用LipofectamineTM2000將pcDNA3.1(+)-8×PAR4-ami表達載體轉染人腸癌細胞SW6

7、20,G418篩選抗性細胞克隆,Western Blot檢測PAR4表達,獲得穩(wěn)定轉染人工microRNA表達載體的SW620細胞。同樣轉染pcDNA3.1(+)空載體至SW620細胞并篩選G418抗性細胞克隆,提取基因組DNA,以PCR法鑒定穩(wěn)定轉染細胞。
　　 2.2 MTT法檢測PAR4表達抑制對SW620細胞在體外生長能力的影響:
　　 將人工microRNA表達載體穩(wěn)定轉染組(SW620/pcDNA3.1(+)

8、-8×PAR4-ami)空載體轉染對照組(SW620/pcDNA3.1(+))和未轉染對照組(SW620)分別接種于96孔板,培養(yǎng)0～5天,加MTT孵育,用DMSO溶解結晶,在570 nm處讀取吸光度值,繪制生長曲線。結果顯示,轉染人工microRNA表達載體的細胞與兩個對照組相比,生長呈明顯減慢的趨勢,均有顯著差異(P＜0.01)。
　　 2.3軟瓊脂集落形成法檢測PAR4表達抑制對SW620細胞體外生長能力的影響:
　

9、　 將上述三組細胞分別在用RPM11640配制的0.33％軟瓊脂中培養(yǎng)14天后,計數各組細胞形成的多于50個細胞的克隆數,結果顯示,轉染人工microRNA表達體的SW620細胞的軟瓊脂克隆形成數量與兩個對照組相比均有顯著差異(P＜0.01)。
　　 2.4劃痕試驗檢測PAR4表達抑制對SW620細胞體外遷移能力的影響:
　　 將處于指數生長期的上述三組細胞分別接種于六孔板,加絲裂霉素C處理24h后換正常的含10％小牛

10、血清的RPMI1640培養(yǎng)液,用10μl加樣槍頭在六孔板中劃痕,分別培養(yǎng)0、2、4、6天,在倒置顯微鏡下觀察并記錄劃痕邊緣細胞向空白區(qū)擴散運動情況。結果顯示在第0、2天各組細胞無明顯差異,第4、6天人工microRNA表達載體穩(wěn)定轉染細胞向劃痕區(qū)擴散減慢,與兩個對照組相比出現較為明顯的差異。
　　 2.5 Transwell法檢測PAR4表達抑制對SW620細胞穿膜運動能力的影響:
　　 將上述三組細胞分別懸浮于無血清培

11、養(yǎng)液中接種到置于24孔板的Transwell小室中,外加正常含血清培養(yǎng)液培養(yǎng)3天后結晶紫染色,在400倍顯微鏡下計數穿膜細胞數。結果顯示,轉染pcDNA3.1(+)-8×PAR4-ami的細胞組遷移能力與兩個對照組細胞均有顯著差異(P＜0.01)。
　　 2.6流式細胞術檢測PAR4表達抑制對SW620細胞周期的影響:
　　 將上述三組細胞接種于六孔板培養(yǎng),收集細胞,PBS洗滌后,用70％乙醇溶液4℃固定過夜,以PBS洗

12、滌細胞后,碘化丙啶染色,流式細胞儀測定細胞周期分布。結果顯示,PAR4表達抑制可以引起SW620細胞G2/M期減少。
　　 3.IC50法測定PAR4表達抑制對SW620細胞藥物敏感性的影響:
　　 取處于對數生長期的上述三組細胞,接種96孔板中,加入不同濃度的5-氟尿嘧啶和順鉑,培養(yǎng)3天后用MTT法進行檢測,計算IC50。結果顯示,抑制PAR4的表達可以明顯提高SW620細胞對5-氟尿嘧啶和順鉑的耐藥性(P＜0.01)